小鼠股骨CT分析在阿侖膦酸鈉去卵巢小鼠骨質(zhì)量及臟器病理學(xué)的應(yīng)用

文獻(xiàn)信息

近日，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院、中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室、甘肅省干細(xì)胞與基因藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室共同合作的研究成果“阿侖膦酸鈉對(duì)去卵巢小鼠骨質(zhì)量及臟器病理學(xué)的影響”在學(xué)術(shù)期刊《海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)》上發(fā)表。平生公司的Micro-CT(型號(hào)：NMC-200)產(chǎn)品為論文提供了重要的小鼠股骨Micro-CT圖像和定量分析。

 

該研究的通訊作者為甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院陳克明教授。第一作者為甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院在讀研究生王龍飛。

文獻(xiàn)摘要

探究阿侖膦酸鈉對(duì)去卵巢小鼠骨質(zhì)量和臟器病理學(xué)的影響

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩?0只SPF級(jí)C57雌性小鼠隨機(jī)分為3組，每組10只，分別為假手術(shù)組(Sham)，去卵巢組(OVX)和去卵巢+阿侖膦酸鈉組(ALN)，ALN組每周阿侖磷酸鈉400µg/kg 皮下注射2次，Sham組和OVX組每周等體積的生理鹽水皮下注射2次，給藥12周后取材，分別觀察臟器系數(shù)、主要臟器病理學(xué)切片、骨組織病理學(xué)切片、分析micro CT、L4椎體生物力學(xué)和血清生化指標(biāo)。

 

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：Sham組子宮系數(shù)(0.0054±0.0007)顯著高于OVX組(0.0026±0.0009)和ALN組(0.0025±0.0007)小鼠的子宮系數(shù)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。主要臟器未發(fā)現(xiàn)明顯的病變和毒副作用。骨組織脫鈣切片ALN組與OVX 組相比骨小梁結(jié)構(gòu)致密，脂肪細(xì)胞較少。micro CT結(jié)果顯示，ALN組的Tb.BMD、Tb.N、Tb.Th和Tb.BV/TV與OVX組相比，均有顯著性增加，但Tb.Sp數(shù)值顯著性減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。L4 zhui體生物力學(xué)中ALN組的彈性模量(50.29±13.43)和最大載荷數(shù)(29.83±4.92)顯著高于OVX組的彈性模量(14.77±3.12)和最大載荷數(shù)(11.57±3.18)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。ALN組血清中骨形成指標(biāo)OCN和PINP OVX組相比都呈上升趨勢(shì)，骨吸收指標(biāo)TRACP-5b和CTX-I都呈下降趨勢(shì)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

 

實(shí)驗(yàn)結(jié)論：阿侖膦酸鈉可能是通過(guò)增加骨密度、改善骨微結(jié)構(gòu)、提高骨強(qiáng)度、促進(jìn)骨形成、抑制骨吸收從而提高骨質(zhì)量，并且對(duì)臟器沒(méi)有明顯的毒副作用。

 

實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組處理

8周齡SPF級(jí)C57BL/6小鼠30只，體重(18±2)g，購(gòu)自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK(陜)2019-001。飼養(yǎng)于聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證編號(hào)：SYXK(軍)2017-0047。小鼠造模前按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，每組10只，分別為假手術(shù)組(Sham)、去卵巢組(OVX)及去卵巢+阿侖膦酸鈉組(ALN)。除Sham組切除卵巢體積相同脂肪外，其余各組均由背部行雙側(cè)卵巢摘除術(shù)。術(shù)后連續(xù)肌注3天青霉素。ALN組每周阿侖磷酸鈉400µg/kg皮下注射次，Sham組和OVX組每周等體積的生理鹽水皮下注射2次。為防止切卵巢后小鼠體重上升過(guò)快，每天給小鼠定量喂食，所有小鼠的喂食量按照假手術(shù)組每天進(jìn)食量給予，術(shù)后周開(kāi)始給藥。實(shí)驗(yàn)期間注意皮毛的色澤、觀察小鼠生理反應(yīng)與生活習(xí)性的變化，每一周稱一次體重。給藥第12周處死小鼠取材，取材前禁食不禁水24小時(shí)。

 

Micro CT分析

小鼠取材時(shí)，每組隨機(jī)挑出6根左側(cè)股骨固定在4%多聚甲醛中。固定好的樣本存放于4℃冰箱內(nèi)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，用鑷子取出樣本并用紗布擦走多余的液體后，用干凈的紙巾將樣品包裹放入Micro CT設(shè)備中。掃描后得到大量層切圖片，再經(jīng)重建軟件進(jìn)行3D重建，截取最大剖面圖與橫截面圖。選擇骨骺線下1mm至1.5mm處為感興趣區(qū)進(jìn)行分析，得到分析區(qū)域松質(zhì)骨的骨形態(tài)參數(shù)。選擇骨 骺線下 2.5mm至3mm處為感興趣區(qū)進(jìn)行分析，得出該區(qū)域皮質(zhì)骨的骨形態(tài)參數(shù)。得到橫截面圖、最大剖面圖以及骨形態(tài)參數(shù)包括骨小梁骨密度(Tb.BMD)、骨小梁數(shù)(Tb.N)、骨小梁分離度(Tb.Sp)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨體積分?jǐn)?shù)(Tb.BV/TV)、皮質(zhì)骨密度(Ct.BMD)和皮質(zhì)骨厚度(Ct.Th)。

 

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Micro CT 掃描及分析

股骨正中剖面圖(圖3)顯示，OVX組與Sham組相比，松質(zhì)骨比較疏松， 骨小梁數(shù)量減少，骨小梁間間距擴(kuò)大，骨小梁與骨小梁間的連續(xù)性與延展性較差。其中ALN組與Sham組相比，股骨松質(zhì)骨的骨微結(jié)構(gòu)質(zhì)量基本一致。從骨小梁橫切圖(圖4)顯示，OVX組骨小梁比較稀疏，Sham組和ALN組明顯更加緊密。從骨小梁3D圖(圖5)看出OVX組骨小梁數(shù)目明顯較少，Sham組和ALN組骨小梁數(shù)目明顯較多。從皮質(zhì)骨3D圖(圖6)和皮質(zhì)骨橫切(圖7)未發(fā)現(xiàn)OVX組與Sham組和ALN組的明顯差異。

 

由表2可見(jiàn)，通過(guò)比較松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨的骨形態(tài)參數(shù)，發(fā)現(xiàn)ALN組的小鼠與OVX組小鼠比較，數(shù)值在Tb.BMD、Tb.N、Tb.Th 和Tb.BV/TV均有顯著性增加、Tb.Sp數(shù)值顯著性減少(P＜0.01)，證明ALN提高骨質(zhì)量，是通過(guò)增加骨密度和改善骨組織的結(jié)構(gòu)。ALN組與OVX組的Ct.BMD和Ct.Th比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

 

圖3  小鼠股骨Micro CT成像分析最大剖面圖

 

 
圖4  小鼠股骨Micro CT成像分析骨小梁橫切 

 
圖5  小鼠股骨Micro CT成像分析骨小梁3D

圖6 小鼠股骨Micro CT成像分析皮質(zhì)骨3D

 

圖7  小鼠股骨Micro CT成像分析皮質(zhì)骨橫切

 

文獻(xiàn)結(jié)論

Micro CT是骨組織微觀結(jié)構(gòu)鑒定的新方法，可以從三維層面精準(zhǔn)地反映皮質(zhì)骨與松質(zhì)骨的微結(jié)構(gòu)。Micro CT有直觀、準(zhǔn)確和靈敏度高等特點(diǎn)，是骨科基礎(chǔ)疾病研究常用的一種有效的可靠手段，特別在骨質(zhì)疏松癥相關(guān)的大小鼠實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用最多。本次以實(shí)驗(yàn)小鼠股骨為對(duì)象，分析最大剖面圖與立體三維重建圖，通過(guò)二維和三維的角度分析小鼠股骨的微觀結(jié)構(gòu)并得到準(zhǔn)確的松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨量化指標(biāo)結(jié)果。直觀體現(xiàn)松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨的微觀構(gòu)造，同樣得到皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨量化數(shù)值。Micro CT結(jié)果顯示，ALN都能增加骨小梁數(shù)量、加大骨小量厚度、減小骨小梁間距、加強(qiáng)骨小梁的連續(xù)性，使得松質(zhì)骨內(nèi)部的骨小量更加緊致，在微觀層面加強(qiáng)骨質(zhì)量并提高骨強(qiáng)度。說(shuō)明ALN可以預(yù)防小鼠切卵巢引起骨的丟失，增加骨質(zhì)量。

    Micro CT（型號(hào)：NEMO）（平生醫(yī)療科技）

影像軟件：Avatar（平生醫(yī)療科技）