小鼠肺類器官對減少、增加和循環(huán)拉伸的反應

大多數(shù)肺部疾病與肺某些區(qū)域的應變降低（例如肺炎、特發(fā)性肺纖維化、先天性膈疝 （CDH）或增加（例如肺氣腫、哮喘）有關。胎兒腔內氣管阻塞術（FETO）是一種新興的CDH治療方法，可以在宮內達到改善肺發(fā)育的目的。美國辛辛那提兒童醫(yī)院醫(yī)療中心及辛辛那提大學醫(yī)學院的研究團隊曾使用CDH和FETO作為肺力學重要性的案例研究，因為CDH，氣管阻塞（TO）和正常狀態(tài)分別代表三種不同的機械力學發(fā)育環(huán)境：拉伸應變減少，拉伸應變增加和循環(huán)拉伸應變。這三種狀態(tài)在肺發(fā)育的細胞培養(yǎng)或類器官模型中均未被考慮。

體外力學模型主要集中在經受單軸或雙軸應變的二維（2D）表面上培養(yǎng)的細胞。這些還原論模型為特定細胞類型的機械反應性提供了重要的見解。例如，在培養(yǎng)的肺成纖維細胞中，瞬時受體電位陽離子通道亞家族V成員4（TRVP4）是關鍵的機械轉導調節(jié)因子，而Piezo1在調節(jié)肺上皮細胞分裂以響應張力中很重要。然而，理解這些發(fā)現(xiàn)在體內的相對重要性和評估細胞-細胞或細胞-基質相互作用是困難的。

該團隊使用動物肺的體內模型克服了其中的一些困難，但機械輸入不容易操縱，人類細胞也不容易研究。為了克服這些限制，其開發(fā)了兩種機械轉導的肺類器官模型。第一種是類器官破壞（DIS）或佛司可林（FSK）誘導的類器官腫脹的簡單模型，以研究靜態(tài)應變增加和減少的影響。FSK增加細胞內環(huán)磷酸腺苷（cAMP）水平，并已被證明可引起人鼻上皮類器官的類器官腫脹。第二個模型是將循環(huán)拉伸應用于類器官。這是第一篇描述減少、增加和循環(huán)的拉伸對肺類器官基因表達影響的研究。

FSK介導的腫脹和類器官破壞模型

為了在類器官模型中模擬氣管阻塞和先天性膈疝的影響，對小鼠肺類器官（mLOs）進行了破壞和FSK介導的腫脹實驗。FSK在4小時和20小時誘導mLO橫截面積增加37%和59%，而破壞分別導致mLO橫截面積減少 48%和68%。對照mLO橫截面積在同一時間內分別增加了7%和24%，與正常的類器官生長一致（圖1 A）。在破壞前（圖1 B）、破壞后立即（圖1 C）和破壞后20小時（圖1 D）進行活細胞膜染色的mLOs雙光子共聚焦顯微鏡圖像顯示，類器官壁出現(xiàn)相當大的破壞，類器官大小減小。

圖1   小鼠肺類器官（mLOs）FSK和破壞模型。

FSK和DIS小鼠肺類器官中機械敏感基因的鑒定

這種實驗方法的一個挑戰(zhàn)是區(qū)分那些對FSK敏感的基因和那些對機械敏感的基因，了解一些基因可能兩者兼而有之。結果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SK誘導了近三分之一的細胞外基質基因，并且該實驗模型偏向于顯示機械轉導基因誘導。在排除FSK敏感基因之前，F(xiàn)SK / DIS和FSK緊密聚集在一起，但在去除這些基因后，F(xiàn)SK/DIS 與 DIS更緊密聚集在一起。僅使用DIS，F(xiàn)SK和對照組進行基因集富集分析。排除這些轉錄本后，保留了11805個基因并進行了分析。將轉錄本限制在校正P值<0.1且表達有兩倍變化的轉錄本中，F(xiàn)SK與對照組的轉錄本為715個，DIS與對照組的轉錄本為1081個，F(xiàn)SK與DIS的轉錄本為760個。
 

受FSK誘導的類器官腫脹和類器官破壞影響的通路和過程

令人驚訝的是，F(xiàn)SK 與對照組以及 DIS 與對照組數(shù)據(jù)集之間存在 344 個共享的 DEGs，被激活的基因主要參與細胞周期和先天免疫相關過程。

盡管FSK和DIS都改變了細胞骨架組織，但只有DIS下調了與管發(fā)育、呼吸系統(tǒng)發(fā)育和細胞粘附相關的過程。FSK與對照組相比沒有顯著差異，但DIS下調了許多與糖胺聚糖和鞘糖脂代謝相關的通路。DIS和FSK都增加了與免疫反應相關的基因表達，盡管系統(tǒng)中不存在免疫細胞。IPA分析鑒定了許多常見的細胞增殖調節(jié)因子，例如Yes相關蛋白（YAP）和FOXM1，與FSK相比，干擾素和轉化生長因子β（TGF-β）在DIS中的預測調節(jié)作用降低。調控網(wǎng)絡分析發(fā)現(xiàn)了許多相同的調控元件，DIS中的干擾素反應因子降低，泛素和趨化調節(jié)因子在DIS中增加。盡管集落刺激因子-2 （CSF2）、Erb-b2 受體酪氨酸激酶 2（ERBB2）和表皮生長因子受體（EGFR）等調節(jié)因子在 DIS 和 FSK 中均升高，但 FSK 中的調節(jié)因子通常更高，這表明 FSK 的細胞增殖受可溶性因子的影響更大。

為了驗證這些發(fā)現(xiàn)，對PCNA陽性細胞進行了流式細胞術。與其他組相比，F(xiàn)SK mLOs顯示出細胞增殖增加的證據(jù)。總之，盡管這種mLO FSK和DIS實驗設計降低了識別FSK敏感基因變化的能力，但該模型表明，增加的機械應變會激活細胞周期，盡管FSK不會促進間充質細胞譜系基因和相關調控通路的發(fā)展，但DIS確實抑制了它們。
 

循環(huán)拉伸模型

為了表征mLO基因表達響應循環(huán)拉伸的差異，開發(fā)了循環(huán)拉伸實驗裝置，該裝置可以在組織培養(yǎng)中對嵌入的肺類器官施加雙軸循環(huán)拉伸（0.1 Hz，10.25%，20h）。在未拉伸狀態(tài)和拉伸狀態(tài)之間可以觀察到明顯的mLO體積增加。使用雙光子共聚焦顯微鏡測量硅膠插入物內基質膠的高度和三個mLOs在基線和拉伸后的體積。結果表明，基質膠高度的測量顯示體積減少了7.6%，但類器官體積的測量顯示體積增加了約50%。這些數(shù)據(jù)表明，將循環(huán)雙軸應變應用于mLOs會導致類器官體積的周期性變化。
 

循環(huán)機械拉伸對mLO基因表達的影響

實驗對類器官進行了20小時的循環(huán)拉伸，并從這些mLOs 中提取RNA，mLO 承受相同大小的靜態(tài)拉伸以及不施加拉伸。PCA揭示了靜態(tài)和無拉伸mLOs之間的相似性，以及這兩組和循環(huán)拉伸mLOs具有良好的分離性（圖2 A）。由于靜態(tài)和無拉伸mLOs相似，將它們與對照循環(huán)拉伸mLOs進行比較，以確定循環(huán)拉伸是否激活了與細胞外基質結構和組織、細胞-基質粘附和間質發(fā)育相關的GO生物過程。結果表明，與先天免疫相關的過程下調（圖2 B）。GO分子功能項的統(tǒng)計學強度相對較弱，其中“蛋白激酶活性”增加，“單糖結合”和“氧化還原酶活性”降低最為顯著（圖2 C）。ToppGene通路分析發(fā)現(xiàn)，通過整合素進行的細胞-基質相互作用在循環(huán)拉伸中最為顯著地上調（圖2 D）。與靜態(tài)拉伸和無拉伸相比，循環(huán)拉伸降低了大量與肺上皮細胞相關的基因豐度，并增加了與平滑肌細胞和成纖維細胞相關的基因數(shù)量（圖2 E）。與GO分子功能類似，基因家族分析受到統(tǒng)計功效的限制，fermitins 上調，peroxiredoxins 降低。Fermitins調節(jié)整合素-基質相互作用。IPA上游調控（圖2 G）和主調控（圖2 H）分析結果表明：1）循環(huán)拉伸通過SIRT3改變組蛋白乙酰化；2）STAT信號，MAP激酶激活和轉化生長因子α上調；3）TGF-β和MyD88信號降低，microRNAs和長非編碼RNAs的變化可能介導許多觀察到的基因表達變化。這些數(shù)據(jù)表明，循環(huán)拉伸促進從上皮細胞功能向細胞外基質和間質細胞的成熟和組織的轉變。
 

圖2   循環(huán)拉伸模型的mLOs分析。

循環(huán)拉伸對間充質細胞變化的影響

已知許多由循環(huán)拉伸改變的通路在間充質細胞發(fā)育中很重要，因此實驗量化了在無拉伸、靜態(tài)拉伸或循環(huán)拉伸下的類器官嵌入20小時后α平滑肌肌動蛋白（αSMA）陽性和血小板衍生生長因子受體α（PDGFRα）陽性細胞的百分比。結果表明，循環(huán)拉伸導致αSMA陽性和αSMA-PDGFRα雙陽性細胞幾乎翻倍，但PDGFRα陽性細胞的總豐度沒有增加（與該受體在幾種細胞類型中表達一致，圖3 A-D）。這些數(shù)據(jù)支持循環(huán)拉伸在肺間充質細胞成熟中的作用。

圖3   肺成纖維細胞在循環(huán)拉伸下的變化。
 

總之，研究發(fā)現(xiàn)，在該mLO模型中，增加和減少的靜態(tài)拉伸誘導細胞增殖，應變的不斷降低會下調許多肺部發(fā)育通路，而增加的應變會激活細胞周期，但對肺部發(fā)育通路沒有影響。循環(huán)拉伸促進幾種不同肺間充質細胞譜系的發(fā)育，激活TGF-β和表觀遺傳和轉錄后調控機制，并增加αSMA和PDGFRα陽性細胞的豐度。循環(huán)拉伸對于肺間充質細胞相關過程很重要。
 

參考文獻：Joshi R, Batie MR, Fan Q, Varisco BM. Mouse lung organoid responses to reduced, increased, and cyclic stretch. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2022 Jan 1;322(1):L162-L173. doi: 10.1152/ajplung.00310.2020. Epub 2021 Dec 1. PMID: 34851724; PMCID: PMC8794016.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34851724/、
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