低流體剪切應(yīng)力激活的Smad2/3信號通路介導(dǎo)動脈向內(nèi)重塑

脊椎動物血管系統(tǒng)的設(shè)計使局部灌注與每個組織的代謝需求相匹配，從而優(yōu)化功能并最終存活。例如，缺氧會在短時間內(nèi)誘導(dǎo)擴張小阻力血管因子的分泌，而在長時間內(nèi)則會誘導(dǎo)刺激血管生成因子的分泌。這些調(diào)整增加了受影響組織的大動脈的流量，誘導(dǎo)其向外重塑。相反，組織的萎縮會導(dǎo)致血管密度降低和供血動脈向內(nèi)重塑。

排列在血管內(nèi)表面的內(nèi)皮細胞（ECs）傳遞來自血流動力學(xué)壁流體剪切應(yīng)力（FSS）的信號以調(diào)節(jié)血管重塑。多項研究表明，增加或減少動脈血流的手術(shù)干預(yù)分別刺激向外或向內(nèi)重塑。目前的證據(jù)支持內(nèi)皮細胞編碼FSS設(shè)定值介導(dǎo)體內(nèi)平衡的模型。持續(xù)高于或低于這個值的FSS會引起向外或向內(nèi)的重塑，從而使FSS恢復(fù)到原始值。相比之下，設(shè)定值附近的FSS穩(wěn)定了血管。不同類型的內(nèi)皮細胞的設(shè)定值不同，對應(yīng)于特定血管類型的剪切應(yīng)力生理水平。對于人臍靜脈ECs（HUVECs），生理 FSS 在 10-20 dynes/cm2 的范圍內(nèi)，抑制炎癥性NF-κB，而Smad1/5信號在此范圍內(nèi)被最大程度激活。

轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β/骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）家族成員通過信號傳導(dǎo)調(diào)控細胞反應(yīng)，包括從早期發(fā)育階段到成年生活和疾病的增殖，分化和遷移。已經(jīng)表明，TGF-β/BMP家族配體和受體在剪切應(yīng)力調(diào)控血管穩(wěn)態(tài)中的作用。

耶魯大學(xué)心血管研究中心、羅格斯大學(xué)高級生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)中心、上海市免疫學(xué)研究所等研究團隊以前的研究表明，Smad1/5在生理設(shè)定值附近的激活和核易位是由其受體Alk1和內(nèi)皮糖蛋白觸發(fā)的。流動激活是通過對循環(huán)TGF-β家族配體BMP9和BMP10的敏感性增加約20倍介導(dǎo)的。與血管穩(wěn)定的作用一致，這些受體的突變或缺失會誘發(fā)脆弱且容易破裂的血管畸形。其他研究表明，相關(guān)的Smad2/3通路也被血流激活，但是，在這種情況下，激活被生理層流FSS抑制，并由振蕩FSS激活，這是動脈粥樣硬化易感區(qū)域的典型特征。這些結(jié)果促使該團隊研究了Smad2/3信號在血流依賴性血管重塑中的作用。

剪切應(yīng)力激活Smad2/3 

用1-30 dynes/cm2 的FSS 處理 HUVECs 持續(xù)12 小時誘導(dǎo) Smad2/3 核易位，其在低 FSS（1-5 dynes/cm2）下達到最大值，然后隨著FSS達到生理范圍（≥12 dynes/cm2）后顯著降低（圖1 A、B）。細胞排列的平行評估（圖1 C）證實了對FSS的預(yù)期大小反應(yīng)。兩個Smad2/3 直接靶基因—纖連蛋白和整合素α5 的 qPCR 表明，它們的表達遵循相似的大小依賴性，在低 FSS 時達到最大值（圖1 D、E）。這種反應(yīng)被小干擾RNA（siRNA）介導(dǎo)的Smad2/3 缺失阻斷，證實了它們對Smad2/3活性的依賴性。因此，ECs中的Smad2/3信號顯示雙相調(diào)節(jié)，在低FSS時最大。

TGF-β受體通常通過關(guān)鍵絲氨酸殘基的C端磷酸化啟動R-Smad信號傳導(dǎo)。因此，實驗研究了剪切應(yīng)力強度（1-30 dynes/cm2）在12小時內(nèi)對 Smad2/3 C 末端磷酸化（p-Smad2/3 C）的影響。在 12 小時的時間過程中，p-Smad2/3 在流動開始后約 2-4 小時達到峰值，然后下降到高于基線的平臺期（圖1 F）。然而，與核易位不同，p-Smad2/3在高FSS下沒有降低。因此，雖然流動誘導(dǎo)p-Smad2/3 C，但它不像核易位那樣對FSS大小表現(xiàn)出相同的雙相依賴性。因此，在高FSS下抑制核定位和基因誘導(dǎo)必須涉及一種獨特的機制。

圖1   Smad2/3受剪切應(yīng)力調(diào)節(jié)。

受體和配體的鑒定

為了確定哪些受體介導(dǎo)Smad2/3的流動激活，首先考慮了Alk5（TGFβR1），這是TGF-β的主要I型受體，還考慮了神經(jīng)纖毛蛋白-1（Nrp1），基于最近的一份報告，它與Alk1和Alk5相互作用，并參與VEGFR2的FSS激活。結(jié)果表明，Alk5 和 Nrp1 是 Smad2/3 流動激活所需的關(guān)鍵受體，就像 Alk1 和內(nèi)皮糖蛋白是 Smad1/5 流動激活所需的關(guān)鍵受體一樣。

通過類比Smad1/5的流動激活中對BMP9或BMP10的要求，接下來討論了可溶性配體的作用。無血清培養(yǎng)基中FSS未能激活細胞中Smad2/3，表示需要一個或多個循環(huán)因子。TGF-β是刺激Smad2/3活化的主要Alk5配體。然而，濃度為1 pg/mL-10 ng/mL的TGF-β2與剪切應(yīng)力沒有協(xié)同作用。由于流動增強了BMP9或BMP10對Smad1/5的激活，于是接下來測試了這些配體。結(jié)果表明，F(xiàn)SS對Smad2/3活化的增強是由于對BMP9而非相關(guān)配體的敏感性增加。

 

誘導(dǎo)的體內(nèi)向內(nèi)重塑

接下來使用部分頸動脈結(jié)扎模型檢查了體內(nèi)低流量介導(dǎo)的向內(nèi)重塑。兩個頸動脈分支的結(jié)扎（圖2 A）急劇減少了血流，這通常導(dǎo)致內(nèi)膜-內(nèi)側(cè)增厚和管腔面積減少30%至40%（圖2 B）。對側(cè)頸動脈血流也有代償性增加，但向外重塑要少得多。實驗首先討論了低FSS是否在體內(nèi)激活了Smad2/3。大鼠和小鼠的頸動脈結(jié)扎（圖2 C、D）后頸動脈上游ECs中的Smad2/3核染色增加。通過EC特異性敲除（ECKO）Alk5降低了小鼠的這種作用。因此，Smad2/3在體內(nèi)被低FSS激活，這需要Alk5。

此外，阻斷Smad2/3激活是否會減少低流動誘導(dǎo)的動脈向內(nèi)重塑。在野生型小鼠中，右頸動脈周長減少了18%，對應(yīng)面積減少了33%，而Alk5 ECKO小鼠沒有顯著變化（圖2 E）。這些數(shù)據(jù)表明，Alk5-Smad2/3信號通路是低流動誘導(dǎo)的向內(nèi)動脈重塑所必需的。

圖2   低流動誘導(dǎo)的體內(nèi)向內(nèi)重塑。

 

高FSS下的抑制

Smad2/3 的雙相流動激活表明，在高 FSS 下激活的另一種通路拮抗 p-Smad2/3 核易位。敲除小鼠MEKK3通過激活TGFβR1-Smad2/3通路觸發(fā)自發(fā)的向內(nèi)動脈重塑。MEKK2 和 MEKK3 是在高 FSS 下誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子 Klf2 表達的途徑中的上游組分。該通路介導(dǎo)eNOS和其他促進血管舒張和穩(wěn)定血管系統(tǒng)的基因表達。因此，研究了siRNA介導(dǎo)的MEKK3缺失對Smad2/3信號流動激活的影響。敲低MEKK3在低剪切下影響不大，但在高FSS下消除了Smad2/3核轉(zhuǎn)運的抑制（圖3 A、B）。因此，高-流量抑制Smad2/3功能需要MEKK3。

接下來，測試了Klf2在這條通路中的作用。敲低Klf2后，ECs受到不同幅度的FSS。同樣，Klf2缺失在低FSS下幾乎沒有影響，但在高FSS下阻止Smad2/3的抑制（圖3 C、D）。eNOS是一種經(jīng)過充分驗證的Klf2靶基因。兩種不同的抗eNOS siRNAs在高流量條件下對eNOS幾乎完全敲低，但對Smad2/3核定位沒有影響。這一結(jié)果表明，必須有其他靶基因介導(dǎo)Smad2/3活性的抑制作用。然而，Klf2調(diào)控了數(shù)百個EC基因的表達，這使得鑒定具有挑戰(zhàn)性。因此需要更仔細地研究高剪切下核排斥機制。

 

圖3   MEKK3和Klf2在高FSS下抑制Smad2/3。

 

Smad2/3連接區(qū)磷酸化

Smad2/3抑制的一個重要機制涉及連接N端MH1和C端MH2結(jié)構(gòu)域的“連接區(qū)”區(qū)域中絲氨酸和蘇氨酸殘基的磷酸化。因此，實驗測量了低FSS和高FSS下的Smad2/3連接區(qū) 的磷酸化。結(jié)果表明，在高FSS下，多個連接區(qū)域絲氨酸的磷酸化顯著增加。為了確定這種機制是否介導(dǎo)高FSS下的核排斥，轉(zhuǎn)染了四個關(guān)鍵殘基中攜帶Smad3突變的細胞。該突變體在高剪切下保存細胞核。接下來又測試了MEKK3和Klf2在連接區(qū)磷酸化中的作用。任何一種蛋白質(zhì)的缺失都減少了高FSS誘導(dǎo)的連接區(qū)磷酸化。這些數(shù)據(jù)共同表明，通過MEKK3-Klf2通路的高流量誘導(dǎo)的Smad2/3連接區(qū)磷酸化介導(dǎo)了高剪切下Smad2/3核易位的抑制。

已知的 Smad 連接區(qū)激酶包括絲裂原活化蛋白激酶（Erk、Jnk 和 p38）、周期蛋白依賴性激酶（CDKs）、Rho相關(guān)蛋白激酶Akt、鈣調(diào)素依賴蛋白激酶和糖原合酶激酶-3。然而，實驗注意到CDK被Klf2抑制，并預(yù)測靶向CDKs將在高剪切下被激活，從而可能介導(dǎo)觀察到的Smad連接區(qū)磷酸化。最近的研究表明，高FSS下的動脈ECs處于G1停滯晚期，表明CDK4或CDK2的激活。因此，實驗專注于CDK2和CDK4。CDK2的敲低在高剪切下強烈阻斷細胞中的核排斥，而CDK4 敲低幾乎沒有影響。此外，CDK2 敲低阻斷連接區(qū)磷酸化。綜合這些結(jié)果，得出結(jié)論，CDK2是連接區(qū)磷酸化所必需的。

接下來評估了Klf2調(diào)控的CDK抑制劑（CDKN2B、CDKN1A）的作用。CDKN2B的敲低而不是CDKN1A的敲低逆轉(zhuǎn)了高流量下ECs中Klf2缺失的影響。因此，MEKK3-Klf2通路的CDKN2B下調(diào)，隨后CDK2激活，介導(dǎo)Smad2/3連接區(qū)磷酸化和高FSS抑制。

 

CDK在體內(nèi)的抑制作用

最后，研究了該通路是否在體內(nèi)起作用。黃酮吡醇已被用于癌癥患者的人體臨床試驗。然而，這種化合物在循環(huán)中的半衰期很短（∼30分鐘）。注射高劑量（7.5 mg/kg）黃酮吡啶醇的小鼠肺動脈和股動脈的內(nèi)皮顯示p-Smad2核染色增加數(shù)倍（圖4 A-D）。這些結(jié)果證實了CDKs在動脈血流下阻止Smad2/3核易位中的作用。接下來，討論了這種處理是否會引起血管重塑。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射3天中的2天的小鼠存活率更高，因此，根據(jù)該方案注射3周。肺血管系統(tǒng)在MEKK3 敲低后最容易重塑。對整個肺切片的檢查顯示，血管的平滑肌肌動蛋白（SMA）覆蓋率顯著增加（圖4 E），右心室血壓顯著升高（圖4 F）。

這些數(shù)據(jù)共同定義了一條通路，其中MEKK3-Klf2-CDK2通過Smad2/3連接區(qū)磷酸化抑制高FSS下的Smad2/3核易位，以限制生理流大小的向內(nèi)重塑。
 

​圖4   CDK在體內(nèi)的抑制作用。

 

總之，該文分析了調(diào)節(jié)動脈管腔大小的信號網(wǎng)絡(luò)，從而分析了它們將血液輸送到組織的能力。管腔直徑處于嚴密的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)下，以使動脈血流與下游組織的需求相匹配。然而，在動脈粥樣硬化中，這種調(diào)控受到破壞，導(dǎo)致血流受限和組織缺血。闡明Smad2/3通路在低流量下被特異性激活以觸發(fā)向內(nèi)重塑，從而恢復(fù)正常的剪切應(yīng)力水平，不僅揭示了生理調(diào)節(jié)的機制，而且還解釋了病變動脈中炎癥因子激活同一通路如何導(dǎo)致動脈受限。

參考文獻：Deng H, Min E, Baeyens N, Coon BG, Hu R, Zhuang ZW, Chen M, Huang B, Afolabi T, Zarkada G, Acheampong A, McEntee K, Eichmann A, Liu F, Su B, Simons M, Schwartz MA. Activation of Smad2/3 signaling by low fluid shear stress mediates artery inward remodeling. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021 Sep 14;118(37):e2105339118. doi: 10.1073/pnas.2105339118. PMID: 34504019; PMCID: PMC8449390.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34504019/

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