肺纖維化經(jīng)典動物模型存在“胞內(nèi)羥脯氨酸印記”現(xiàn)象的相關(guān)研究成果

論文發(fā)表 | 在肺纖維化領(lǐng)域的重要新發(fā)現(xiàn)，被雜志審稿人評價可以“move the field forward”

 

文獻(xiàn)信息

近日，廣州醫(yī)科大學(xué)呼吸疾病國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室蘇金教授課題組在肺纖維化領(lǐng)域有重要新發(fā)現(xiàn)，相關(guān)研究成果以“Intracellular Hydroxyproline Imprinting Following Resolution of Bleomycin-Induced Pulmonary Fibrosis”為題發(fā)表在 Eur Respir J（IF=16.67）。該研究論文的第一作者為貴州醫(yī)科大學(xué)宋盛仁博士和廣州醫(yī)科大學(xué)呼吸疾病國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的傅振利博士等，通訊作者為蘇金教授和鐘南山院士。

該研究借助多種新技術(shù)方法，揭示了肺纖維化經(jīng)典動物模型存在“胞內(nèi)羥脯氨酸印記”現(xiàn)象，不僅平息了該領(lǐng)域關(guān)于動物模型長達(dá)20年的爭議，還為肺纖維化嚴(yán)重程度評價提供了多維度技術(shù)手段，被雜志審稿人評價可以“move the field forward”。

文獻(xiàn)背景：

1、特發(fā)性肺纖維化現(xiàn)狀

特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）的特征是異常的傷口愈合反應(yīng)，導(dǎo)致肺內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)過度沉積，從而導(dǎo)致勞力性呼吸困難、慢性咳嗽、肺功能下降和生活質(zhì)量受損等癥狀。肺纖維化疾病的全球致死率高，藥物研發(fā)失敗率高，在過去10年，145項(xiàng)針對肺纖維化的藥物研發(fā)僅有2項(xiàng)[1]。IPF的五年存活率僅為25%，確診患者中位生存期僅為3-5年，因此被稱為“不是癌癥的癌癥”[2]。到目前為止，盡管吡非尼酮和尼達(dá)尼布這兩種藥物都減緩了疾病的進(jìn)展，但它們不能治愈IPF，并且需要增加新的治療方法來提高患者的生存率。

 

2、肺纖維化臨床前模型的未來前進(jìn)方向

由于IPF具有與年齡相關(guān)的特發(fā)性和高度復(fù)雜的基礎(chǔ)病理生物學(xué)特性，因此從整體上來說，其臨床前動物建模本身具有一定的挑戰(zhàn)性。迄今為止，沒有任何一種動物模型能夠完全概括人類IPF病程發(fā)展的所有方面。但無論選擇哪種臨床前模型，都需要對肺纖維化進(jìn)行準(zhǔn)確的分析。纖維化終點(diǎn)評估包括膠原蛋白含量的生化定量分析（羥脯氨酸分析），纖維化分布的組織學(xué)評估以及其他參數(shù)，例如基因表達(dá)、肺功能以及放射成像等。

 

為什么大量的IPF臨床藥物試驗(yàn)都未能取得成功，在動物模型中有效的藥物中，90%在臨床上被證明無效。目前肺纖維化在臨床上主要依據(jù)高分辨率CT（HRCT）掃描和肺活檢確診，越來越多的臨床前模型研究建議采用臨床肺纖維化的評估方法，減少藥物在臨床前與臨床研究的結(jié)果差異。博來霉素是誘導(dǎo)動物肺纖維化的常用藥物。ATS研討會報(bào)告提出，氣管內(nèi)博來霉素滴注模型是可用于臨床前測試最典型的動物模型[3]，盡管由博來霉素模型誘導(dǎo)肺纖維化的組織病理學(xué)模式與普通型間質(zhì)性肺炎（UIP）并不完全一致。廣州醫(yī)科大學(xué)呼吸疾病國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室肺纖維化學(xué)組將micro-CT（設(shè)備型號：SNC-100，平生醫(yī)療科技（昆山）有限公司）影像學(xué)技術(shù)結(jié)合多種技術(shù)手段平息了以往20年肺纖維化研究領(lǐng)域關(guān)于小鼠肺纖維化自愈與否的爭論，揭示了纖維化自愈的分子機(jī)制，同時為抗纖維化藥效學(xué)評價提供了重要方法學(xué)。在肺纖維化動物模型及評價方法中，羥脯氨酸含量測定是肺纖維化程度評價的 “金標(biāo)準(zhǔn)”[3]。但羥脯氨酸含量不僅無法避免動物個體差異所致結(jié)果偏差，還無法判斷纖維化主要指標(biāo)膠原的存在狀態(tài)。因此，肺纖維化動物模型還有待進(jìn)一步提高和優(yōu)化其評估的手段。

 

肺纖維化動物模型通常采用終點(diǎn)測量方法如膠原含量、組織學(xué)Ashcroft評分[4]、基因表達(dá)、組織學(xué)、肺功能等生化評估來評估肺纖維化程度和藥物療效。盡管這些終點(diǎn)測量提供肺纖維化水平有價值的評價結(jié)果，但它們不能提供肺纖維化的全貌信息。目前大多數(shù)肺纖維化研究很少測量相關(guān)的功能指標(biāo)，如肺功能下降或氣體交換受損，而這些變化是 IPF 臨床上的重要標(biāo)志，部分原因是很難在小鼠中穩(wěn)定地測量這種變化。

 

為了評估治療方案中干預(yù)措施的真正作用，作者需要知道在給藥時是否、何時以及有多少纖維化和炎癥存在，因此只能通過使用非侵入性技術(shù)，如微計(jì)算機(jī)斷層掃描 (μCT) 成像實(shí)現(xiàn)。高分辨率 micro-CT 成像可用于動態(tài)和無創(chuàng)地用于動物模型的診斷和監(jiān)測肺纖維化狀態(tài)，是研究和量化肺纖維化等肺部疾病負(fù)擔(dān)的一項(xiàng)特別出色的技術(shù)，它可確立其對標(biāo)準(zhǔn)終點(diǎn)評估（如組織學(xué)和羥脯氨酸分析）的非侵入性附加信息。Micro-CT能夠單獨(dú)縱向可視化和量化每只動物的炎癥和纖維化過程，從而確定治療何干預(yù)的窗口。因此，肺纖維化臨床前研究應(yīng)建議從放射成像入手，在活體內(nèi)觀測藥物干預(yù)對肺纖維化的影響。肺纖維化發(fā)病過程中大量的成纖維細(xì)胞聚集和分泌ECM，使肺泡腔及肺間質(zhì)結(jié)構(gòu)在放射成像上與含空氣的正常肺泡有顯著的差異，基于這一特點(diǎn)，micro-CT的后續(xù)影像分析為作者了解臨床前動物模型的肺泡通氣含量情況，或進(jìn)一步分析肺纖維化正常通氣、通氣不良和不通氣的肺內(nèi)情況提供了更直觀和準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。因此可作為作者整體評估肺纖維化動物模型的優(yōu)先選擇標(biāo)準(zhǔn)。

 

實(shí)驗(yàn)方法：

使用雄性C57BL/6J小鼠（6-8周）。博來霉素溶解于無菌0.9%生理鹽水中，每只動物氣管滴注2.0mg/kg.對照組滴注生理鹽水。將小鼠隨機(jī)分為七個體重匹配的實(shí)驗(yàn)組：（1）博萊霉素，第1周；（2） 博萊霉素，第2周；（3） 博萊霉素，第3周；（4） 博萊霉素，第4周；（5） 博萊霉素，第10周；（6） 博萊霉素，第16周；（7）生理鹽水。為了描述博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化的時間過程，第（6）組小鼠在博萊霉素滴注前和滴注博萊霉素后第1、2、3、4、7、10、12和16周，使用顯微計(jì)算機(jī)斷層掃描（micro-CT）分析（平生醫(yī)療科技（昆山）有限公司，設(shè)備型號：SNC-100，中國）獲取連續(xù)動態(tài)CT圖像。

 

用異氟醚麻醉小鼠，使用 Super Nova CT（平生醫(yī)療科技（昆山）有限公司，型號：SNC-100）獲取的，并使用Avatar軟件分析（中國平生醫(yī)療科技（昆山）有限公司）進(jìn)行分析。對軸位和冠狀位圖像進(jìn)行分析，以確定相同的體內(nèi)體征（如右支氣管分叉），這些體征被定義為纖維化區(qū)域。

 

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

 

肺部的顯微CT圖像。在博萊霉素給藥后不同時間點(diǎn)獲取軸向（上排）和相應(yīng)冠狀（下排）顯微CT圖像，劑量為2.0毫克/千克。在每個時間點(diǎn)，用紅方標(biāo)記小鼠右支氣管的分叉，以確保在所有CT圖像中選擇相同位置的區(qū)域.

 

 

肺通氣的定量CT容積評估。a） 第4周博萊霉素治療小鼠肺部CT圖像的代表性彩色圖。藍(lán)色：正常充氣區(qū)域；黃褐色：通氣不良的區(qū)域；紅色：非充氣區(qū)域。b） 博萊霉素?fù)p傷后指定時間點(diǎn)代表性小鼠肺CT充氣容積的動態(tài)百分比。c） 肺CT充氣量的統(tǒng)計(jì)計(jì)算。

 

總結(jié)：

通過評估肺纖維化動物模型中的生化定量和臨床相關(guān) CT 和肺功能衍生定量來彌合臨床前和臨床研究之間的差距，將對確定治療靶點(diǎn)和化合物的研究效率產(chǎn)生關(guān)鍵影響。放射影像技術(shù)以及更多的臨床相關(guān)性為研究人員提供了縱向檢查單個動物肺纖維化進(jìn)展的機(jī)會，而不必犧牲許多動物來檢查纖維化。這些方法的應(yīng)用更好地模擬了評估臨床前肺纖維化模型的臨床相關(guān)終點(diǎn)指標(biāo)，可能意味著新的治療方法更多地能夠從體內(nèi)模型走向臨床轉(zhuǎn)化，為肺纖維化的患者治療帶來新的希望。

 

參考文獻(xiàn)：

[1]   KOLB P, UPAGUPTA C, VIERHOUT M, et al. The importance of interventional timing in the bleomycin model of pulmonary fibrosis [J]. The European respiratory journal, 2020, 55(6):

[2]   MIKOLASCH T A, GARTHWAITE H S, PORTER J C. Update in diagnosis and management of interstitial lung disease  [J]. Clin Med (Lond), 2017, 17(2): 146-53.

[3]   JENKINS R G, MOORE B B, CHAMBERS R C, et al. An Official American Thoracic Society Workshop Report: Use of Animal Models for the Preclinical Assessment of Potential Therapies for Pulmonary Fibrosis [J]. American journal of respiratory cell and molecular biology, 2017, 56(5): 667-79.