支原體檢測試劑盒說明書(QPCR法）

瀏覽次數(shù)：589　發(fā)布日期：2023-8-1　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

【產(chǎn)品規(guī)格】

BPM50 50 次/盒

【產(chǎn)品說明】

支原體(mycoplasma)：目前發(fā)現(xiàn)的最小的原核生物，據(jù)統(tǒng)計約 15~35% 的細(xì)胞被支原體污染。支原體污染會改變宿主細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能，易致實驗結(jié)果不穩(wěn)定，須對培養(yǎng)細(xì)胞定期進(jìn)行支原體檢測。

本產(chǎn)品試劑盒采用雙色熒光 qPCR (TaqMan 探針法)檢測支原體DNA，檢測對象為細(xì)胞培養(yǎng)的上清液或細(xì)胞本身。該試劑盒具有以下特點：

靈敏：配合高效 DNA 提取試劑盒，檢測靈敏度達(dá) 10cfu/mL。

穩(wěn)定：全程閉管操作，無交叉污染。

可靠：含內(nèi)參基因，避免假陰性。

方便：操作簡單，無需電泳步驟。

定量：以 CT 值判斷，可定量檢測。

【運輸及保存條件】

低溫冷凍運輸， -20℃保存，有效期 1 年。

【產(chǎn)品組分】

組分名稱 BPM50
Mycoplasma Probe qPCR SuperMix 900µL

Mycoplasma Positive Control 100µL

RNase Free Water 100µL

注：Positive Control 濃度為 2×10 3拷貝/µL。本試劑盒提供試劑，使用前先低速離心后小心開啟。使用時請上下輕柔顛倒十次混勻，避免起泡，并低速短暫離心后使用。

【操作步驟】

1. 樣本制備（自備）

A 樣本的標(biāo)準(zhǔn)制備方案：請使用高效DNA 提取試劑盒取樣本 DNA。推薦使用無微生物污染級別的核酸提取試劑盒。低溫保存的血清、臍帶血、胰酶、抗生素、未使用的培養(yǎng)液等生物制品，即使存在支原體污染，一般支原體含量也較少，建議提取樣本DNA 后檢測。

B 樣本的簡易快速制備方案：可用于細(xì)胞培養(yǎng)上清、細(xì)胞懸液、血液，樣本制備步驟如下。

（1）細(xì)胞培養(yǎng)上清：取 1~1.5mL 細(xì)胞培養(yǎng)上清；

（2）細(xì)胞懸液：直接取 2µL 細(xì)胞懸液作為模板進(jìn)行qPCR 反應(yīng)。要求樣本內(nèi)細(xì)胞總數(shù)量不超過 10000 個，樣本可用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋400 rpm 離心 3 分鐘；取 2µL 上清作為模板進(jìn)行qPCR反應(yīng)。

（3）血液：直接取血液樣本作為模板進(jìn)行 qPCR 反應(yīng)。注意血液中的細(xì)胞對PCR反應(yīng)有較強(qiáng)抑制作用，內(nèi)參檢測通道會顯示異常。根據(jù)不同應(yīng)用場景，有兩個建議：①中間質(zhì)控環(huán)節(jié)，對靈敏度要求中等，無需達(dá)到10cfu/mL，可用無菌水稀釋 10 倍，充分混勻后，取 2µL作為模板進(jìn)行 qPCR 反應(yīng)。②放行檢測，要求靈敏度達(dá)到10cfu/mL，建議提取樣本DNA 后檢測。

2. qPCR 反應(yīng)體系及條件

反應(yīng)體系以20µL為例：

PCR 儀設(shè)置以 ABI 7500 為例，相對定量模式，選擇

TaqMan 探針法：

【閾值設(shè)置】

以ABI 7500 為例，擴(kuò)增曲線選擇 log 法，基線設(shè)置3~15 個循環(huán)。建議用 log 法擴(kuò)增曲線保證結(jié)果穩(wěn)定可靠。

（1）內(nèi)參(HEX/VIC)閾值設(shè)定：以陰性對照定內(nèi)參擴(kuò)增曲線閾值，將內(nèi)參的CT 值定為 27±2。

（2）支原體(FAM)閾值設(shè)定：以陽性對照定支原體擴(kuò)增曲線閾值，將支原體(FAM)的CT值定為 26±3。

說明：

如果陽性對照管的支原體(FAM)CT 值>30，但陽性對照管及陰性對照管的內(nèi)參(HEX)CT 值正常，表明陽性支原體對照模板有降解。

如果陰性對照管的內(nèi)參(HEX/VIC)CT值>30，陽性對照管的內(nèi)參(HEX)CT值>30 且支原體(FAM)CT值>30，表明 Mycoplasma Probe qPCR SuperMix 試劑成分已失效。

【結(jié)果判讀】