高流體剪切應(yīng)力抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞中細(xì)胞因子驅(qū)動(dòng)的Smad2/3活化

血管內(nèi)表面的內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）從流動(dòng)的血液中感知流體剪切應(yīng)力（FSS），以調(diào)節(jié)數(shù)千種基因的表達(dá)并深刻影響EC表型。動(dòng)脈粥樣硬化的一個(gè)主要模式是可溶性炎癥介質(zhì)和剪切應(yīng)激之間的協(xié)同作用，如高FSS阻斷炎癥轉(zhuǎn)錄通路的激活，如NF-kB（核因子κB）和c-Jun N-末端激酶，而低剪切應(yīng)力允許或增強(qiáng)這些反應(yīng)。轉(zhuǎn)錄因子KLF2由高FSS強(qiáng)烈誘導(dǎo)，并被認(rèn)為介導(dǎo)其抗動(dòng)脈粥樣硬化作用的很大一部分。

研究發(fā)現(xiàn)，由TGFβ（轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β）分泌升高和ECs對(duì)TGFβ的敏感性增加驅(qū)動(dòng)的內(nèi)皮到間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EndMT）是動(dòng)脈粥樣硬化的主要原因。重要的是，TNFα（腫瘤壞死因子α）、白細(xì)胞介素1β（IL1β）和γ干擾素等細(xì)胞因子使ECs對(duì)TGFβ敏感，從而促進(jìn)EndMT。事實(shí)上，TGFβ受體的內(nèi)皮特異性敲除可顯著減小斑塊大小，甚至誘導(dǎo)斑塊消退，這支持TGFβ信號(hào)通路在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和進(jìn)展中的作用。

在美國(guó)耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院內(nèi)科心血管研究中心、細(xì)胞生物學(xué)系、生物醫(yī)學(xué)工程系團(tuán)隊(duì)的以往研究中表明，細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子Smad2/3的激活和核易位在低FSS下顯示出明顯的最大值，這歸因于一個(gè)敏感的激活機(jī)制，該機(jī)制由 ≈1 dyne/cm2 的剪切力觸發(fā)，并被 >15 dyne/cm2的高FSS抑制。然而，這些影響在炎癥和動(dòng)脈粥樣硬化背景下的更廣泛意義尚未得到探索。因此，該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步探索了高FSS在調(diào)控TGFβ-Smad2/3-EndMT通路以響應(yīng)可溶性致動(dòng)脈粥樣硬化生成因子中的作用，相關(guān)成果發(fā)表在Journal of the American Heart Association 題為High Fluid Shear Stress Inhibits Cytokine-Driven Smad2/3 Activation in Vascular Endothelial Cells。
 

首先，將基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的HUVECs在4 dynes/cm2 或25 dynes/cm2 的FSS或0.5±4 dynes/cm2 的振蕩剪切應(yīng)力（OSS）下添加TGFβ2或不添加的處理?xiàng)l件下持續(xù)6小時(shí)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TGFβ2單獨(dú)誘導(dǎo)了強(qiáng)烈的Smad2/3核易位，并在低FSS或OSS下進(jìn)一步增加，但幾乎完全被高FSS阻斷（圖1 A、B）。此外還測(cè)量了與間充質(zhì)表型相關(guān)的Smad2/3靶基因，特別是FN1（纖連蛋白1）、N-鈣粘蛋白、ID1（DNA結(jié)合抑制劑）、Snail2（蝸牛家族轉(zhuǎn)錄抑制因子2）和MMP2（基質(zhì)金屬蛋白酶2）；還研究了細(xì)胞間粘附分子1（ICAM-1），它在動(dòng)脈粥樣硬化中介導(dǎo)白細(xì)胞募集到動(dòng)脈壁，并由Smad2/3和NF-kB誘導(dǎo)。結(jié)果表明，低FSS對(duì)TGFβ的反應(yīng)略有增加，而高FSS基本上消除了TGFβ誘導(dǎo)的Smad2/3靶基因的表達(dá)（圖1 C）。因此，高FSS抑制TGFβ信號(hào)通路。

炎癥介質(zhì)在激活動(dòng)脈粥樣硬化中的EC Smad2/3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用，主要是使細(xì)胞對(duì)TGFβ敏感。因此，實(shí)驗(yàn)將HUVECs用炎性細(xì)胞因子IL1β處理，施加或不施加4 dynes/cm2 或25 dynes/cm2  的FSS或 0.5±4 dynes/cm2 的OSS并持續(xù)12小時(shí)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL1β單獨(dú)誘導(dǎo)Smad2/3核易位，在LSS或OSS下進(jìn)一步增加，但基本上完全被高FSS抑制。使用TNFα處理觀察到幾乎相同的結(jié)果。Smad2/3靶基因的測(cè)定證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)。因此，炎癥誘導(dǎo)的Smad2/3信號(hào)傳導(dǎo)也受到高FSS的抑制。

圖1   FSS在體外阻止TGFβ2誘導(dǎo)的Smad2/3信號(hào)通路。

接下來(lái)，為了在體內(nèi)驗(yàn)證這些結(jié)果，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了注射TGFβ的小鼠的高FSS /動(dòng)脈粥樣硬化保護(hù)區(qū)域和低FSS /動(dòng)脈粥樣硬化易感區(qū)域的內(nèi)皮反應(yīng)，分別使用主動(dòng)脈的外彎曲和內(nèi)彎曲作為高和低/振蕩FSS區(qū)域。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TGFβ強(qiáng)烈誘導(dǎo)內(nèi)彎曲Smad2/3核易位，但在外彎曲作用微弱（圖2 A、B）。對(duì)Smad2/3誘導(dǎo)基因，纖連蛋白和ICAM-1的檢測(cè)表明，TGFβ同樣誘導(dǎo)它們?cè)趦?nèi)彎曲而不是外彎曲中的表達(dá)（圖2 C-F）。因此，體內(nèi)效果與體外效果呈相關(guān)性。

此外，實(shí)驗(yàn)同樣試圖驗(yàn)證IL1β和TNFα在體內(nèi)的影響。向小鼠注射炎性細(xì)胞因子（IL1β和TNFα），隨后在主動(dòng)脈的不同區(qū)域檢查Smad2/3核易位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL1β和TNFα均誘導(dǎo)Smad2/3在內(nèi)彎曲中易位，但在外彎曲中沒(méi)有；IL1β和TNFα誘導(dǎo)的Smad2/3誘導(dǎo)蛋白，纖連蛋白和ICAM-1同樣在內(nèi)彎曲而不是外彎曲中表達(dá)。因此，體內(nèi)Smad2/3信號(hào)傳導(dǎo)的激活與低FSS區(qū)域相關(guān)，并且在高FSS區(qū)域中基本上無(wú)法檢測(cè)到。

圖2   FSS抑制體內(nèi)TGFβ信號(hào)傳導(dǎo)。
 

最后，為了確認(rèn)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的基因表達(dá)通過(guò)Smad2/3發(fā)生，實(shí)驗(yàn)利用siRNA介導(dǎo)的敲低在HUVECs中沉默Smad2/3，然后用TGFβ2或IL1β在4 dynes/cm2 或25 dynes/cm2 的FSS下處理ECs，并采用定量PCR分析基因表達(dá)。結(jié)果表明，Smad2/3敲低在所有條件下阻斷了TGFβ2-和IL1β-誘導(dǎo)的FN1和N-鈣粘蛋白的增加（圖3 A、B）。因此，這些基因在ECs中的表達(dá)是Smad2/3依賴性的，Smad2/3在體外介導(dǎo)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的基因表達(dá)。
 

圖3   Smad2/3敲低阻斷TGFβ2或IL1β誘導(dǎo)的體外基因表達(dá)。

總之，該研究表明，低和振蕩FSS增強(qiáng)，而高FSS抑制Smad2/3信號(hào)傳導(dǎo)和間充質(zhì)和炎癥基因的表達(dá)，以響應(yīng)TGFβ和炎性細(xì)胞因子（IL1β和TNFα）。因此，這些結(jié)果更新并擴(kuò)展了高流量通過(guò)其對(duì)炎癥途徑的影響抑制動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的主要模式，包括最近闡明的TGFβ-Smad2/3-EndMT機(jī)制。這些結(jié)果闡明了一種控制動(dòng)脈粥樣硬化病變部位選擇性的新機(jī)制。低和紊亂的FSS通過(guò)細(xì)胞因子放大Smad2/3活化，而高FSS則有效抑制。因此，這些作用導(dǎo)致在血液流量低而趨于紊亂的區(qū)域優(yōu)先形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，炎癥和EndMT之間的正反饋促進(jìn)疾病進(jìn)展。

參考文獻(xiàn)：Deng H, Schwartz MA. High Fluid Shear Stress Inhibits Cytokine-Driven Smad2/3 Activation in Vascular Endothelial Cells. J Am Heart Assoc. 2022 Jul 19;11(14):e025337. doi: 10.1161/JAHA.121.025337. Epub 2022 Jul 15. PMID: 35861829; PMCID: PMC9707828.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35861829/
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