協(xié)同抗炎成骨的n-HA白藜蘆醇?xì)ぞ厶菑?fù)合微球用于骨質(zhì)疏松性骨再生

文獻(xiàn)信息

近日，昆明醫(yī)科大學(xué)科技成果孵化中心、云南省干細(xì)胞和再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南省第一人民醫(yī)院口腔科，云南省第三人民醫(yī)院內(nèi)分泌科等單位的研究成果“Synergistic anti-inflammatory and osteogenic n-HA/resveratrol/chitosan composite microspheres for osteoporotic bone regeneration（協(xié)同抗炎成骨的n-HA/白藜蘆醇/殼聚糖復(fù)合微球用于骨質(zhì)疏松性骨再生）在雜志Bioactive Materials（IF：14.593）上發(fā)表。平生公司的離活一體Micro CT（型號(hào)NEMO）在論文中提供了重要的大鼠股骨圖像和定量分析。

該研究的通訊作者為桂莉和陸聲教授，第一作者為李麗梅、于瑪麗和李瑤。

文獻(xiàn)背景：

隨著社會(huì)人口老齡化，骨質(zhì)疏松性骨缺損的治療在臨床上面臨巨大挑戰(zhàn)，開發(fā)一種兼具治療骨質(zhì)疏松癥和促進(jìn)骨缺損再生修復(fù)的功能材料具有重要意義。通常地，移植材料伴隨著炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)和促炎因子的大量分泌，阻礙了缺損骨的修復(fù)。本研究設(shè)計(jì)了納米羥基磷灰石（n-HA）/白藜蘆醇（Res）/殼聚糖（CS）復(fù)合微球，通過局部緩釋Res，創(chuàng)造有利的微環(huán)境，促進(jìn)成骨。體外釋放研究證實(shí)了n-HA/Res/CS微球用于Res控釋的可行性。值得注意的是，微球具有顯著的抗炎活性，表現(xiàn)為促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和iNOS在RAW264.7細(xì)胞中的表達(dá)呈劑量依賴性下降。此外，復(fù)合微球增強(qiáng)了骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在微球上的粘附和增殖，表明復(fù)合微球有利于細(xì)胞生長(zhǎng)。Runx2、ALP、Col-1和OCN的上調(diào)以及成骨介質(zhì)中的大量礦化支持了增強(qiáng)骨分化的能力。當(dāng)植入骨質(zhì)疏松性大鼠股骨髁的骨缺損中時(shí)，增強(qiáng)的軟骨內(nèi)骨愈合和骨再生表明，n-HA /Res /CS復(fù)合微球更有利于受損的骨折愈合。結(jié)果表明，優(yōu)化的nHA／Res／CS復(fù)合微球可作為骨質(zhì)疏松性骨缺損／骨折治療的多功能填料。

實(shí)驗(yàn)方法：

骨質(zhì)疏松模型

為建立骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型，對(duì)大鼠進(jìn)行雙側(cè)卵巢切除（OVX）。簡(jiǎn)言之，在戊巴比妥鈉（30毫克/千克）的作用下，大鼠雙側(cè)腰部皮膚接受1厘米的線性切口。對(duì)于OVX大鼠，輕輕移除兩個(gè)卵巢。然后重新定位并縫合組織層。手術(shù)后，皮下注射青霉素（0.05毫克/千克）以抗感染。2個(gè)月后，根據(jù)先前的研究，此時(shí)應(yīng)已建立骨質(zhì)疏松模型。

臨界骨缺損模型

將上述成功制備的骨質(zhì)疏松性大鼠麻醉處理后，制造直徑為3 mm、高度為3 mm的缺損，植入復(fù)合微球，骨蠟處理后，逐層縫合。手術(shù)后，皮下注射青霉素（0.05毫克/千克）以抗感染。6 周后取材。

Micro-CT分析

用顯微CT系統(tǒng)（NEMO，NMC-100，平生醫(yī)療科技有限公司）分析植入物（n=3）。簡(jiǎn)單地說，將試樣置于樣品架中，在以下條件下掃描：掃描分辨率，7.5μm；電源電壓90 kV，電流0.06 mA，由采集軟件Cruiser（平生公司）完成。為了定量評(píng)估缺陷內(nèi)的成骨，通過連接到Micro CT的分析軟件Avatar（平生公司）選擇直徑為2.5 mm、高度為2.5 mm的感興趣區(qū)域（ROI），以表示內(nèi)部再生骨。這得出了骨密度（BMD）、骨體積/總體積（BV/TV）、連接密度（Conn.D）、小梁厚度（Tb.Th）、小梁分離（Tb.Sp）和小梁數(shù)量（Tb.N）。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

顯微CT成像顯示，負(fù)載Res的微球改善了成骨能力（圖10a）。CM-0組再生不良，缺損區(qū)組織數(shù)量有限。CM-50的作用略大于CM-30和CM-40，但CM-30和CM-40之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明釋放Res以劑量依賴性方式有效促進(jìn)骨形成。值得注意的是，CM-50組可見部分組織橋接，大量新生骨向缺損區(qū)中心擴(kuò)展。與3D圖像觀察一致，隨著負(fù)載Res含量的增加，BMD、BV/TV、Conn.D、Tb⋅Th，Tb⋅N增加，Tb.Sp降低（圖10b）。這表明各組之間已經(jīng)形成了骨組織。與其他組相比，高Res負(fù)荷CM-50組顯示出更強(qiáng)的骨重建能力。

n-HA /Res /CS復(fù)合微球的體內(nèi)骨重建。（a） 6周時(shí)各組的顯微CT圖像，藍(lán)色虛線圓圈表示原始缺陷區(qū)域。（b） 股骨缺損內(nèi)骨再生的顯微CT參數(shù)。BMD：骨密度；BV /TV：骨體積/總體積；連接D：連接密度；Tb⋅Th：小梁厚度；Tb.Sp：小梁分離；Tb⋅N：小梁數(shù)。誤差條表示平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3）（***p<0.001；**p<0.01；*p<0.05）。（有關(guān)此圖例中顏色參考的解釋，請(qǐng)讀者參考本文的Web版本。）

文獻(xiàn)結(jié)論：

采用乳化化學(xué)交聯(lián)法制備了生物相容性n-HA／Res／CS復(fù)合微球。該系統(tǒng)能夠操縱Res的藥物釋放曲線，影響RAW264.7細(xì)胞的抗炎程度。正如預(yù)期的那樣，負(fù)載Res的微球在炎癥標(biāo)記物、TNF-α、IL-1β和iNOS的下調(diào)方面引發(fā)了增強(qiáng)的抗炎反應(yīng)。體外和體內(nèi)評(píng)價(jià)表明，該復(fù)合微球能夠刺激骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖和骨分化，并在骨質(zhì)疏松條件下促進(jìn)內(nèi)軟骨形成和骨重塑。結(jié)果表明，n-HA /Res /CS復(fù)合微球作為骨填料有可能修復(fù)骨質(zhì)疏松性骨缺損/骨折。

使用設(shè)備：

Micro CT（型號(hào)：NEMO）（平生醫(yī)療科技）

影像軟件：Avatar（平生醫(yī)療科技）