牙囊干細(xì)胞的細(xì)胞外小泡為牙周組織再生提供生化線索

文獻(xiàn)信息

近日，昆明醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院云南口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、昆明醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院正畸科團(tuán)隊(duì)的研究成果“Small extracellular vesicles from dental follicle stem cells provide biochemical cues for periodontal tissue regeneration（牙囊干細(xì)胞的細(xì)胞外小泡為牙周組織再生提供生化線索 ）在雜志Stem Cell Research & Therapy（IF：6.832 ）上發(fā)表。平生公司的離活一體Micro CT（NEMO）在論文中提供了重要的大鼠牙周組織圖像。

該研究的共同通訊作者為胡江天、楊禾豐，共同第一作者為馬麗婭、饒南荃。

文獻(xiàn)摘要

背景：基于干細(xì)胞衍生的細(xì)胞外小囊泡（SEV）療法已被探索作為牙周再生干細(xì)胞移植療法的替代方案。牙囊干細(xì)胞（DFSCs）在再生醫(yī)學(xué)中具有巨大的應(yīng)用潛力。然而，目前尚不清楚DFSC衍生的SEV（DFSCs-SEV）是否可用于牙周再生。本研究旨在探討DFSCs-sEVs能否再生受損的牙周組織及其潛在的機(jī)制。

方法：分離鑒定DFSCs-sEVs，并將其與牙周膜干細(xì)胞（PDLSCs）共培養(yǎng)。使用EdU分析、CCK-8分析、細(xì)胞周期分析、劃痕實(shí)驗(yàn)、茜素紅染色、qRT-PCR和western blot分析，檢測(cè)DFSCs-sEVs對(duì)PDLSCs生物學(xué)行為的影響。RNA測(cè)序和功能富集分析用于檢測(cè)DFSCs-sEVs對(duì)PDLSCs影響的信號(hào)通路。用ERK1/2或p38 MAPK抑制劑預(yù)處理PDLSC，以研究ERK1/2和p38 MAPK通路參與的可能性。此外，將DFSCs-sEVs與膠原海綿復(fù)合移植到SD大鼠牙周組織缺損處，然后用蘇木精-伊紅（HE）染色和Micro CT檢查牙周組織的病理變化。

結(jié)果：PDLSCs可內(nèi)化DFSCs-sEVs，從而通過(guò)EdU分析、CCK-8分析和細(xì)胞周期分析促進(jìn)細(xì)胞增殖。DFSCs-SEV顯著增強(qiáng)了PDLSC的遷移。DFSCs-sEVs促進(jìn)PDLSC的成骨分化，顯示出深茜素紅染色、成骨基因上調(diào)（RUNX2，BSP，COL1）和蛋白表達(dá)上調(diào)（RUNX2，BSP，COL1，ALP）。作者發(fā)現(xiàn)DFSCs-sEVs激活了p38 MAPK信號(hào)通路。特異性抑制劑（SB202190）對(duì)該信號(hào)通路的抑制部分削弱了被DFSCs-sEVs增強(qiáng)的增殖能力。DFSCs-sEVs移植后，大鼠牙周損傷區(qū)可見新的牙周膜樣結(jié)構(gòu)和骨形成。在新形成的牙周膜和缺損區(qū)軟組織中觀察到標(biāo)記的DFSCs-SEV。

結(jié)論：作者的研究表明，DFSCs-sEVs通過(guò)促進(jìn)PDLSC的增殖、遷移和成骨分化，促進(jìn)牙周組織再生。

實(shí)驗(yàn)方法

大鼠牙周缺損模型

本研究共使用72只12周齡雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠。允許動(dòng)物自由獲取水和食物，并將其保存在受控環(huán)境中（50%濕度、25°C和12小時(shí)的明暗循環(huán)）。所有動(dòng)物隨機(jī)分為3組：空白組（未治療，n=24）；膠原蛋白海綿組（CS，n=24）；膠原海綿組負(fù)載DFSCs-sEVs（CS-sEVs，n=24）。如前所述，在大鼠第一磨牙的牙周組織上造成牙周缺損（3×2×1 mm）。按照各組對(duì)大鼠進(jìn)行治療，并在術(shù)后2周、4周和8周采集下頜骨樣本。

Micro CT分析

收集的樣本用4%多聚甲醛固定24小時(shí)。接下來(lái)，使用Micro CT系統(tǒng)（NEMO，NMC-100，中國(guó)昆山平生醫(yī)療有限公司）進(jìn)行采集。使用以下參數(shù)掃描下頜下磨牙區(qū)域：90 kV電壓和60μA電流。重建數(shù)據(jù)，并使用Avatar 1.5.0軟件（PINGSENG Healthcare Inc.）分析缺損區(qū)域的骨體積/組織體積（BV/TV）比和小梁厚度（Tb.Th）。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Micro CT結(jié)果顯示，三組移植后2周未見牙周膜樣組織和新骨形成，移植后4周可見新骨形成。移植4周后，膠原海綿組形成分散的新骨碎片，而DFSCs-sEVs組觀察到彌漫性骨形成，與其他2組相比，DFSCs-sEVs組觀察到更密集的新骨形成（圖7D）。此外，作者發(fā)現(xiàn)DFSC-sEVs組在術(shù)后2周的小梁厚度明顯高于未治療組（圖7E）。此外，三組移植后2、4、8周，DFSCs-sEVs組牙骨質(zhì)與新骨之間均有不同程度的牙周膜樣組織。間隔4周后，與其他兩組相比，DFSCs-sEVs組顯示出高度細(xì)胞化的牙周組織，細(xì)胞垂直于牙骨質(zhì)和牙槽骨，呈現(xiàn)出最多的愈合跡象，這與Micro CT結(jié)果一致。未治療組和膠原海綿組均有結(jié)締組織形成。然而，沒(méi)有一種膠原纖維具有條紋，這些條紋是牙周膜的一個(gè)顯著特征，有序排列并嵌入牙骨質(zhì)之間，覆蓋牙根和牙槽骨窩內(nèi)壁（圖7F）。為了探討DFSCs-SEV的定位和存活，將PKH26標(biāo)記的DFSCs-SEV移植到大鼠牙周缺損區(qū)。移植2周后，在新形成的牙周膜和缺損區(qū)軟組織中觀察到標(biāo)記的DFSCs-SEV，而移植4周后觀察到標(biāo)記較少的DFSCs-SEV（圖7B，C）。這表明DFSCs-sEVs參與了大鼠缺損牙周組織中新的牙周膜樣組織和新骨的形成。

DFSCs-sEVs促進(jìn)大鼠牙周組織再生。A體內(nèi)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。B DFSC-SEV的體內(nèi)定位。細(xì)胞核用DAPI（藍(lán)色）染色，DFSC-SEV用PKH26（紅色）標(biāo)記。白色箭頭顯示DFSCs-SEV。C DFSC-SEV的量化。D具有代表性的顯微CT重建圖像顯示2-8周時(shí)不同組的新骨形成。定量微CT評(píng)估BV/TV（%）、Tb。Th（毫米）。F牙周再生的組織學(xué)評(píng)價(jià)。CS，膠原海綿；nb，新骨；nPDL，新牙周膜；d：牙本質(zhì)*p＜0.05,**p<0.01

文獻(xiàn)結(jié)論

在本研究中，DFSCs-sEVs通過(guò)促進(jìn)PDLSCs的增殖、遷移和成骨分化，促進(jìn)大鼠缺損牙周組織中新的牙周膜樣結(jié)構(gòu)和新骨的形成；這些生理過(guò)程可能部分歸因于p38 MAPK信號(hào)通路的激活。作者的發(fā)現(xiàn)為牙周組織再生中無(wú)細(xì)胞治療策略的發(fā)展提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

使用設(shè)備

Micro CT（型號(hào)：NEMO）（平生醫(yī)療科技）

影像軟件：Avatar（平生醫(yī)療科技）