C-反應(yīng)蛋白基因的基因消融導(dǎo)致大鼠對(duì)肥胖和胰島素抵抗的機(jī)制研究

文獻(xiàn)信息

近日，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院內(nèi)分泌科、重慶內(nèi)分泌與代謝疾病臨床研究中心和重慶三峽中心醫(yī)院內(nèi)分泌科等單位的研究成果Genetic ablation of C-reactive protein gene confers resistance to obesity and insulin resistance in rats（C-反應(yīng)蛋白基因的基因消融導(dǎo)致大鼠對(duì)肥胖和胰島素抵抗）在學(xué)術(shù)期刊DIABETOLOGIA（影響因子10.122）發(fā)表。平生公司的Super Nova^® Micro PET/CT 產(chǎn)品在論文中提供了重要的大鼠脂肪的CT圖像和定量分析，把單CT系統(tǒng)的功能發(fā)揮出來(lái)，實(shí)現(xiàn)了一機(jī)兩用。

 

該研究的通訊作者為楊剛毅教授。第一作者為楊夢(mèng)柳、仇勝。

 

文獻(xiàn)摘要

目的/假設(shè)：除了作為一種傳統(tǒng)的炎癥標(biāo)志物外，C反應(yīng)蛋白（CRP）與肥胖、糖尿病和心血管疾病的發(fā)展密切相關(guān)。作者假設(shè)CRP蛋白直接參與能量和葡萄糖代謝的調(diào)節(jié)，并且CRP基因缺陷會(huì)導(dǎo)致肥胖抵抗和胰島素抵抗。

 

方法：采用轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（TALEN）技術(shù)實(shí)現(xiàn)大鼠CRP基因敲除。將CRP基因缺陷大鼠喂以普通飲食或高脂飲食。檢測(cè)體重、糖代謝、胰島素敏感性、能量消耗和炎癥狀態(tài)的表型變化。在野生型和CRP基因敲除大鼠中，通過(guò)腦室內(nèi)輸送瘦素和CRP并進(jìn)行葡萄糖鉗夾研究，檢測(cè)CRP缺陷對(duì)下丘腦瘦素和胰島素信號(hào)及葡萄糖穩(wěn)態(tài)的影響。

 

結(jié)果：CRP缺陷大鼠高脂飲食后體重和食物攝入顯著減少，能量消耗增加，胰島素敏感性提高。葡萄糖鉗夾研究顯示肝臟胰島素信號(hào)和作用增強(qiáng)。CRP缺乏增強(qiáng)和延長(zhǎng)了中樞瘦素的減肥作用及促進(jìn)了其外周效應(yīng)。相反，將CRP恢復(fù)到基因敲除大鼠的下丘腦中可以減弱中樞瘦素信號(hào)對(duì)胰島素敏感性和外周糖代謝的影響。

 

結(jié)論/解釋：CRP不僅是炎癥和代謝綜合征的血液標(biāo)志物，而且其通過(guò)調(diào)節(jié)下丘腦瘦素信號(hào)直接參與調(diào)節(jié)能量代謝、體重、胰島素敏感性和葡萄糖穩(wěn)態(tài)。

 

實(shí)驗(yàn)方法

動(dòng)物

動(dòng)物Crp-KO大鼠由Cyagen Biosciences公司生產(chǎn)，并飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。Crp-KO SD大鼠通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活物樣效應(yīng)物核酸酶（TALEN）技術(shù)構(gòu)建。簡(jiǎn)而言之，對(duì)大鼠Crp外顯子和內(nèi)含子序列的分析導(dǎo)致了基因缺失位置（外顯子1）的設(shè)計(jì)。作者用它來(lái)構(gòu)建TALEN質(zhì)粒（引導(dǎo)mRNAs的序列：TALEN-1L：T C A C G A T A A G C T T C T C T C , T A L E N - 1 - R :TATAATAGCTCCTACCTT）。體外轉(zhuǎn)錄mRNA的核注射導(dǎo)致F0代陽(yáng)性大鼠的出生，并與野生型（WT）雜交產(chǎn)生雜合子F1代。雜合子F1大鼠與雜合子F1大鼠交配，獲得純合子Crp KO大鼠或雜合子F2或WT同窩仔。通過(guò)測(cè)序確認(rèn)表型。動(dòng)物被安置在一個(gè)溫度和濕度控制的設(shè)施中，有12小時(shí)的光/暗循環(huán)，可以隨意獲得水和食物。所有使用的動(dòng)物均基于其相應(yīng)的基因型，一旦確定其基因型，將其隨機(jī)分配到NCD或HFD喂養(yǎng)組，或隨機(jī)分配到不同的治療組。為了構(gòu)建高脂飲食（HFD）誘導(dǎo)的胰島素抵抗模型，8周齡的雄性WT和Crp-KO大鼠被喂食正常食物（NCD）或HFD（45%脂肪；中國(guó)江蘇醫(yī)學(xué)院）12周。在年齡相關(guān)代謝研究中，8周齡雄性WT和Crp-KO大鼠被喂食HFD 16個(gè)月。

CT成像、重建和分析

使用SuperNova PET /CT（平生醫(yī)療科技有限公司）中的單CT掃描協(xié)議對(duì)大鼠進(jìn)行掃描。脂肪體積分析是基于脂肪的灰度值（CT值）低于其他器官和肌肉。根據(jù)不同的灰度閾值對(duì)脂肪進(jìn)行篩選和分離。Cruiser軟件（版本1.5.0，平生醫(yī)療科技有限公司）用于采集圖像，采集參數(shù)設(shè)置為60 kV管壓、600μA管流、DSD（源焦點(diǎn)到探測(cè)器的垂直距離）510 mm和FOV（視野）110 mm。圖像采集后，使用recon軟件（recon 1.5.0，平生醫(yī)療科技有限公司）進(jìn)行重建。這一過(guò)程是由專業(yè)人員進(jìn)行的。

 

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

CRP缺乏對(duì)能量平衡的影響

為了研究CRP缺乏對(duì)能量穩(wěn)態(tài)的生理影響，使用TALEN技術(shù)制造CRP KO大鼠。CRP-KO大鼠肝臟中未檢測(cè)到CRP蛋白表達(dá)，與WT同窩大鼠相比，循環(huán)CRP水平也為零。定量PCR分析還顯示，脂肪、肌肉和胰腺中的Crp表達(dá)完全被敲除（ESM圖1a-c）。在檢查喂食NCD的Crp KO大鼠的生長(zhǎng)時(shí)，作者發(fā)現(xiàn)體重、脂肪成分和食物攝入沒(méi)有明顯差異（圖1a-g）。此外，直腸溫度（在室溫或4°C下測(cè)量）和熱像圖顯示兩種基因型之間沒(méi)有顯著差異（ESM圖2a，b）。

 

在HFD方案下，突變大鼠和WT大鼠的體重、脂肪體積和能量平衡表型存在差異。因此，與WT大鼠相比，Crp-KO大鼠的體重、脂肪量和食物攝入顯著減少，而瘦體重沒(méi)有顯著變化（圖1a-f）。HFD喂養(yǎng)的KO大鼠的平均每日食物攝入量和累積食物攝入量也低于WT對(duì)照組（圖1f，g）。有趣的是，Crp-KO大鼠幾乎完全抵抗HFD引起的收縮壓和舒張壓升高（圖1h，i）；然而，這種表型似乎伴隨著Crp KO大鼠體重增加的減弱（ESM圖3a，b）。這一表型是否只是體重增加差異的次要表現(xiàn)，還是CRP直接參與血壓調(diào)節(jié)的結(jié)果，仍有待研究。

 

Crp-KO大鼠的體重、脂肪量、食物攝入和血壓減少。8周齡雄性WT和Crp-KO大鼠喂食NCD或HFD 12周。Crp KO可保護(hù)大鼠免受高脂喂養(yǎng)期間體重增長(zhǎng)曲線（a）和累積體重（b）中明顯的體重增加。顯微CT掃描顯示脂肪成分（c、d）和脂肪量（但瘦肉沒(méi)有）顯著減少（e）。在HFD方案下，Crp-KO還導(dǎo)致每日平均攝食量（f）和累積攝食量（g）以及收縮壓（h）或舒張壓（i）下降。數(shù)據(jù)表示為Crp KO大鼠與WT大鼠的平均值±SEM，*p<0.05，**p<0.01（數(shù)據(jù)采用未配對(duì)的Student t檢驗(yàn)）。ATV，脂肪組織體積

 

結(jié)論：

總之，作者首次構(gòu)建了SD大鼠Crp-KO模型，為Crp直接調(diào)節(jié)能量平衡、慢性炎癥、血壓、糖代謝和胰島素敏感性提供了遺傳學(xué)證據(jù)。其中一些病理生理效應(yīng)至少部分是通過(guò)控制炎癥和抑制瘦素的生理功能實(shí)現(xiàn)的。這些發(fā)現(xiàn)明確支持這樣一個(gè)結(jié)論，即肥胖和2型糖尿病患者的血CRP水平升高不僅僅是一個(gè)替代指標(biāo)。降低循環(huán)CRP水平或CRP誘導(dǎo)的瘦素抵抗可能是治療肥胖和2型糖尿病的一種有希望的治療策略。

 

使用設(shè)備

Super Nova^® Micro PET/CT（II 代外觀圖）

影像軟件：Avatar（平生醫(yī)療科技）