卡非佐米調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境以加強(qiáng)癌癥的免疫檢查點(diǎn)治療

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文獻(xiàn)信息

近日，暨南大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生命與健康工程研究所 廣東省高校功能蛋白研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和教育部腫瘤分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室等單位的研究成果“Carfilzomib modulates tumor microenvironment to potentiate immune checkpoint therapy for cancer（卡非佐米調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境以加強(qiáng)癌癥的免疫檢查點(diǎn)治療 ）在雜志EMBO Molecular Medicine（IF：14.260）上發(fā)表。平生公司的活體CT（Supernova）在論文中提供了重要的小鼠肺部腫瘤圖像。

 

該研究的通訊作者陳良、周倩，第一作者為周倩、梁錦霞。

一 文獻(xiàn)背景

PD-1抑制劑對(duì)部分癌癥患者的臨床療效令人印象深刻。然而，仍然迫切需要開(kāi)發(fā)有效的增效劑來(lái)擴(kuò)大其臨床應(yīng)用。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）是一種M2極化巨噬細(xì)胞，可消除或抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤反應(yīng)。將TAM轉(zhuǎn)化為M1巨噬細(xì)胞是一種極具吸引力的抗腫瘤治療策略。在這里，作者進(jìn)行了高通量篩選，發(fā)現(xiàn)卡非佐米能夠有效地驅(qū)動(dòng)M2巨噬細(xì)胞表達(dá)M1細(xì)胞因子，吞噬腫瘤細(xì)胞，并向T細(xì)胞提供抗原。機(jī)制上，卡非佐米誘導(dǎo)未折疊蛋白反應(yīng)（UPR），激活I(lǐng)RE1a以招募TRAF2，激活NF-κB以轉(zhuǎn)錄M2巨噬細(xì)胞中編碼M1標(biāo)記物的基因。在體內(nèi)，卡非佐米通過(guò)將TAMs重新編程為M1樣巨噬細(xì)胞有效地重新構(gòu)建了腫瘤微環(huán)境，并在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中縮小了原位肺癌。更重要的是，卡非佐米與PD-1抗體協(xié)同作用，幾乎完全逆轉(zhuǎn)原發(fā)性肺癌。鑒于卡非佐米在臨床上的安全性，作者的研究表明，卡非佐米與PD-1抑制劑聯(lián)合治療實(shí)體瘤患者可能會(huì)立即得到應(yīng)用。

 

二 實(shí)驗(yàn)方法

體內(nèi)腫瘤模型

一個(gè)月大的TetO-EGFR T790M/Del19；將CC10rtTA雙轉(zhuǎn)基因小鼠（指定為T(mén)D小鼠）喂食含多西環(huán)素的飲食約12周以誘發(fā)肺癌。肺部腫瘤負(fù)荷通過(guò)MicroCT（Supernova、SNC-100、平生醫(yī)療科技有限公司）進(jìn)行監(jiān)測(cè)。確認(rèn)后，將攜帶肺癌的小鼠隨機(jī)分為兩組，分別用卡非佐米（3 mg/kg（iv.）每周三次）和每2天一次的抗小鼠PD1抗體（10 mg/kg（ip.））治療，）。治療2周后，再次行CT檢查，并與治療前的標(biāo)度圖進(jìn)行比較，評(píng)價(jià)療效。然后對(duì)小鼠實(shí)施安樂(lè)死。固定肺組織進(jìn)行病理學(xué)分析。同時(shí)，研磨腫瘤結(jié)節(jié)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。

 

三 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

卡非佐米在歐洲和美國(guó)已被批準(zhǔn)用于治療復(fù)發(fā)和/或難治性多發(fā)性骨髓瘤（MM）。鑒于作者對(duì)其將M2重新編程為M1樣巨噬細(xì)胞的能力的觀察，作者假設(shè)卡非佐米可以重組腫瘤微環(huán)境，并有助于縮小實(shí)體瘤。因此，作者進(jìn)一步在耐藥EGFR突變體驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因小鼠原位肺癌模型中測(cè)試了卡非佐米縮小腫瘤的能力。作者在早期工作后，用含多西環(huán)素（Dox）的飲食喂養(yǎng)TetO-EGFR（T790M/Del19）/CC10-rtTA雙轉(zhuǎn)基因小鼠（指定為T(mén)D小鼠），并誘發(fā)肺腺癌。引人注目的是，計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）顯示卡非佐米治療導(dǎo)致肺部腫瘤顯著消退（圖5A和B）。用克隆體消耗巨噬細(xì)胞顯著損害了卡非佐米的腫瘤收縮作用（圖5A和B，以及EV4A和B），表明巨噬細(xì)胞在介導(dǎo)卡非佐米的治療效果中發(fā)揮了重要作用。病理分析顯示，這些溶媒處理的小鼠的細(xì)胞核形態(tài)高度異質(zhì)性，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)的比率，腫瘤細(xì)胞沿肺泡排列紊亂，表明這些肺癌的惡性性質(zhì)。與此形成鮮明對(duì)比的是，作者在卡非佐米組的肺中檢測(cè)到高度的瘤內(nèi)間隙和較厚的肺泡壁，這表明原來(lái)的腫瘤占位區(qū)域發(fā)生了劇烈的重塑。此外，卡非佐米治療的小鼠的核形態(tài)異質(zhì)性和核與細(xì)胞質(zhì)的比率明顯較輕（圖5C），病理學(xué)證實(shí)了卡非佐米的治療效果。引人注目的是，在卡非佐米和克隆體聯(lián)合治療的小鼠中，這些作用受到嚴(yán)重?fù)p害（圖5C和D）。Ki67染色一致顯示，克隆體聯(lián)合治療削弱了卡非佐米的腫瘤生長(zhǎng)抑制作用（圖5C和D）。

 

作者進(jìn)一步研究了卡非佐米對(duì)體內(nèi)TAMs的影響，發(fā)現(xiàn)卡非佐米治療使TAMs表達(dá)更高水平的CD80，而不是CD86（圖5E和F以及EV4C）。重要的是，卡非佐米治療降低了TME中TAM上CD206的表達(dá)（圖5E和F）。綜上所述，這些結(jié)果表明，卡非佐米在體內(nèi)將TAM重新編程為M1樣巨噬細(xì)胞。

 

同時(shí)，卡非佐米治療增加了腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D8+T細(xì)胞的百分比。這些CD8+T細(xì)胞被激活，因?yàn)樗鼈儗?duì)CD69表達(dá)呈陽(yáng)性（圖5G和H）。值得注意的是，作者觀察到腫瘤浸潤(rùn)的CD4+T細(xì)胞沒(méi)有顯著差異（圖EV4D）。為了進(jìn)一步證實(shí)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)了卡非佐米對(duì)突變型EGFR驅(qū)動(dòng)的肺癌的治療作用，作者用CD11B-DTR轉(zhuǎn)基因小鼠的骨髓重建了致死性照射TD小鼠的免疫系統(tǒng)，然后用含Dox的飲食喂養(yǎng)這些免疫替代小鼠，誘導(dǎo)其發(fā)生原發(fā)性肺癌。白喉毒素（DT）處理可有效清除這些小鼠體內(nèi)的巨噬細(xì)胞（圖EV4E）。用DT處理小鼠后，很大程度上消除了卡非佐米對(duì)TD小鼠肺癌的治療作用（圖5I和J）。

 

圖5

A：巨噬細(xì)胞在通過(guò)卡非佐米介導(dǎo)肺癌萎縮中發(fā)揮作用。用多西環(huán)素飼養(yǎng)TetO-EGFR（T790M/Del19/CC10-rtTA（TD）小鼠3個(gè)月以誘導(dǎo)肺癌。然后在治療前通過(guò)計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）成像記錄腫瘤負(fù)荷。在用生理鹽水（iv.）、克隆體（iv.）、卡非佐米（iv.）或卡非佐米加克隆體治療2周后，再次對(duì)小鼠進(jìn)行CT掃描（PstRx）。通過(guò)ImagJ分析比較PreRx和PstRx的腫瘤面積來(lái)確定治療效果。

I：通過(guò)CD11B-DTR小鼠骨髓的免疫重建，對(duì)巨噬細(xì)胞在介導(dǎo)卡非佐米的腫瘤縮小效應(yīng)中所起作用的基因確認(rèn)。用X射線照射TD小鼠（8Gy，20min），并移植來(lái)自CD11B-DTR小鼠的5×106個(gè)骨髓。通過(guò)多西環(huán)素飲食誘導(dǎo)免疫替代小鼠發(fā)生肺癌。小鼠用生理鹽水（iv.）、DT（ip.）治療2周，卡非佐米（iv.），或卡非佐米加DT。治療前后通過(guò)CT成像記錄腫瘤負(fù)荷。

 

作為專業(yè)的抗原呈遞細(xì)胞，巨噬細(xì)胞積極參與培養(yǎng)T細(xì)胞的抗腫瘤免疫。作者發(fā)現(xiàn)，在RAG1-/-不產(chǎn)生功能性T細(xì)胞的小鼠（圖6A-C），表明T細(xì)胞在這種環(huán)境中起關(guān)鍵作用。為了進(jìn)一步證實(shí)這一結(jié)果，作者使用抗體刪除TD肺癌轉(zhuǎn)基因小鼠中的CD8+（圖EV5A-C）或CD4+（圖EV5D和E）T細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)在刪除任一群體后，卡非佐米的治療效果顯著受損（圖6D和E，以及EV5F和G）。

PD-1抑制劑已廣泛用于增強(qiáng)T細(xì)胞的功能以治療癌癥患者。然而，PD-1抗體未能使大部分癌癥患者受益。例如，驅(qū)動(dòng)因素突變陽(yáng)性肺癌患者對(duì)PD-1抗體治療沒(méi)有反應(yīng)。然后，作者在TD小鼠上測(cè)試了PD-1抗體和卡非佐米的聯(lián)合治療。與早期報(bào)告一致，PD-1抗體單峰治療對(duì)這些EGFR突變型肺癌沒(méi)有明顯的治療效果（圖6F和G）。引人注目的是，作者發(fā)現(xiàn)卡非佐米與PD-1抗體協(xié)同治療TD小鼠中幾乎完全消退（CR）的肺癌（圖6F和G，以及EV5H和I）。作者還發(fā)現(xiàn)，用卡非佐米和PD-1抗體聯(lián)合治療可更有效地激活CD8 T+細(xì)胞（圖6H和I）

 

D：CD4+和CD8+T細(xì)胞在介導(dǎo)Carfilzomib的抑癌作用中發(fā)揮作用。用生理鹽水、卡非佐米、抗小鼠CD4抗體（ip）治療荷肺癌TD小鼠，抗小鼠CD8抗體（ip），或卡非佐米加抗小鼠CD4/8抗體。治療2周后進(jìn)行CT掃描。

F：卡非佐米與PD1抗體協(xié)同治療肺癌。用生理鹽水、抗PD1抗體（ip）、卡非佐米或卡非佐米加抗PD1（ip）治療患有肺癌的TD小鼠。治療2周后進(jìn)行CT掃描。

 

四 文獻(xiàn)結(jié)論

以PD-1抑制劑為例的免疫療法在各種晚期癌癥中產(chǎn)生了前所未有的療效和持久的反應(yīng)。不幸的是，很大一部分患者對(duì)這種治療沒(méi)有反應(yīng)。臨床上迫切需要開(kāi)發(fā)增效劑以擴(kuò)大PD-1抑制劑的使用。在作者目前的研究中，作者發(fā)現(xiàn)卡非佐米和其他蛋白酶體抑制劑在較小程度上將M2重新編程為M1樣巨噬細(xì)胞，從而使更多的CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)并控制體內(nèi)的腫瘤。作者已經(jīng)證明，蛋白酶體抑制激活I(lǐng)RE1a以募集TRAF2，并激活NF-jB以轉(zhuǎn)錄炎性細(xì)胞因子和趨化因子，從而為免疫治療創(chuàng)造有利的腫瘤微環(huán)境。更重要的是，卡非佐米與PD-1抗體協(xié)同作用，以縮小突變EGFR引起的肺癌，而突變EGFR對(duì)PD-1抗體沒(méi)有反應(yīng)。

 

五 使用設(shè)備

Super Nova® Micro CT (平生醫(yī)療科技)

影像軟件: Avatar（平生醫(yī)療科技）