單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和runx2b−− 突變體揭示斑馬魚肌間刺形成的遺傳特征

近日，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院高澤霞教授研究團(tuán)隊聯(lián)合中國科學(xué)院南海海洋研究所林強(qiáng)研究員團(tuán)隊的研究成果“Single-cell transcriptomes and runx2b−/− mutants reveal the genetic signatures of intermuscular bone formation in zebrafish（單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和runx2b−/− 突變體揭示斑馬魚肌間刺形成的遺傳特征）在雜志National Science Review（IF：23.178）上發(fā)表。平生公司的離活一體Micro CT（型號：NEMO）在論文中提供了重要的斑馬魚圖像和定量分析。

該研究水產(chǎn)學(xué)院博士后聶春紅、副教授萬世明、博士生陳宇龍為論文共同第一作者， 水產(chǎn)學(xué)院高澤霞教授和中國科學(xué)院南海海洋研究所林強(qiáng)研究員為論文共同通訊作者， 水產(chǎn)學(xué)院王衛(wèi)民教授參與指導(dǎo)了本研究。

文獻(xiàn)摘要：

肌間刺（IBs）是存在于肌膈間的礦化的硬骨小骨，僅存在低等真骨魚類中。肌間刺一般較小且尖銳，限制了魚的加工方式，如果卡在消費者的喉嚨或口腔中，會造成傷害或創(chuàng)傷，從而影響魚對許多消費者的吸引力。硬骨魚類中肌間刺的發(fā)生發(fā)育還沒有充分了解以及肌間刺形成分子基礎(chǔ)仍有待進(jìn)一步研究。因此，該研究首先利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（scRNA-seq）定義了野生型斑馬魚肌間刺所在區(qū)域的18個細(xì)胞類群，篩選到了肌間刺形成顯著相關(guān)的肌腱祖細(xì)胞、肌腱分化細(xì)胞、成熟肌腱細(xì)胞和成骨細(xì)胞類群。細(xì)胞擬時序分析結(jié)果推測肌間刺是由肌腱祖細(xì)胞經(jīng)肌腱分化細(xì)胞，再分化為成骨細(xì)胞而形成的。根據(jù)基因在細(xì)胞軌跡上的表達(dá)模式，篩選到10個與肌間刺形成密切相關(guān)的功能基因，并在斑馬魚上運用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)分別構(gòu)建了基因突變品系。最終發(fā)現(xiàn)runx2b突變斑馬魚肌間刺完全缺失，且其個體生長、其它骨骼單元形成、肌肉脂肪酸和氨基酸含量等性狀均未受到顯著影響。scRNA-seq分析同時揭示了runx2b突變體斑馬魚的肌間刺發(fā)生區(qū)成骨細(xì)胞數(shù)量的顯著減少，在個體和細(xì)胞水平明確了TGF-β/BMP signaling pathway在肌間刺形成過程中的重要調(diào)控作用。本研究為runx2b調(diào)節(jié)肌間刺形成的關(guān)鍵作用提供了證據(jù)。遺傳育種可以針對runx2b調(diào)節(jié)并創(chuàng)制沒有肌間刺的商業(yè)魚類品種，這可以提高許多養(yǎng)殖魚類品種的安全消費和經(jīng)濟(jì)價值。

實驗方法：

用MS-222對4個月大的runx2b-/-和runx2b+/+斑馬魚實施安樂死，并在4% PFA溶液中固定24小時。共7條魚樣本(4條runx2b+/+， 3條runx2b-/-)使用微計算機(jī)斷層掃描(μCT) (NEMO®Micro CT, 平生醫(yī)療科技有限公司)，體素大小為6μm(使用90kv 電壓，0.06 mA電流)。圖像重建使用Avatar軟件。利于半自動閾值選取脂肪（-200＜CT值≤-80）和肌肉（-80＜CT值≤280）。利用FDK算法，通過三維重建軟件量化脂肪和肌肉的體積。利用標(biāo)準(zhǔn)骨密度模型校準(zhǔn)后測量斑馬魚骨密度。為了鑒定上述runx2b+/+和runx2b-/-斑馬魚的肌間刺表型，作者掃描了斑馬魚脊柱的9-13和19-23區(qū)域(從頭到尾)。runx2b+/+斑馬魚體內(nèi)可以清晰地觀察到肌間刺，而runx2b-/-斑馬魚體內(nèi)則看不到肌間刺(圖5C)。為了保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，在相同掃描條件下對一條完整的斑馬魚進(jìn)行了兩次掃描。

實驗結(jié)果：

圖3 runx2b+/+和runx2b−/−斑馬魚的基因結(jié)構(gòu)和表型特征。C 6μm以下分辨率的Micro-CT掃描顯示runx2b+/+和runx2b−/−斑馬魚的整體骨骼結(jié)構(gòu)。對椎體9-14和19-23區(qū)域進(jìn)行分辨率低于4μm的CT掃描，以顯示IBs的細(xì)節(jié)

圖4比較runx2b+/+和runx2b−/−斑馬魚的游動性、組織和生長特征 (A, B) runx2b+/+和runx2b−/−斑馬魚6種不同骨組織礦物質(zhì)密度(TMD)值。(C, D) runx2b+/+和runx2b−/−斑馬魚肌肉體積的定量;紅色和綠色區(qū)域分別表示肌肉和脂肪

使用設(shè)備：

Micro CT（型號：NEMO）（平生醫(yī)療科技）

影像軟件：Avatar（平生醫(yī)療科技）