CD8+T細(xì)胞效應(yīng)因子功能的無(wú)創(chuàng)性探究監(jiān)測(cè)腫瘤對(duì)免疫治療的早期反應(yīng)

文獻(xiàn)信息

近日，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)同位素研究中心、北京大學(xué)第一醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科等團(tuán)隊(duì)的研究成果Noninvasive interrogation of CD8+T cell effector function for monitoring tumor early responses to immunotherapy（CD8+T細(xì)胞效應(yīng)因子功能的無(wú)創(chuàng)性探究監(jiān)測(cè)腫瘤對(duì)免疫治療的早期反應(yīng)）在學(xué)術(shù)期刊The Journal of Clinical Investigation（影響因子19.456）發(fā)表。平生公司的小動(dòng)物PET/CT（型號(hào)：Super Nova）產(chǎn)品在論文中提供了重要的小鼠PET/CT圖像和定量分析。

該研究的通訊作者為劉昭飛教授、李囡主任醫(yī)師、楊興研究員。第一作者為周昊毅、王琰璞。

文獻(xiàn)信息

準(zhǔn)確識(shí)別對(duì)免疫治療有反應(yīng)的患者在臨床上仍然具有挑戰(zhàn)性。一種非侵入性的方法，可以縱向捕獲有關(guān)免疫細(xì)胞功能的信息，并協(xié)助早期評(píng)估腫瘤反應(yīng)是非常理想的精確免疫治療。在這里，作者展示了正電子發(fā)射斷層掃描(PET)成像使用顆粒酶B靶向放射示蹤劑，命名為⁶⁸Ga-grazytracer，可以無(wú)創(chuàng)和有效地預(yù)測(cè)多種腫瘤模型中對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑和過(guò)繼T細(xì)胞轉(zhuǎn)移治療的反應(yīng)。⁶⁸Ga-grazytracer從多種非醛類肽基示蹤劑中篩選而來(lái)，具有良好的體內(nèi)代謝穩(wěn)定性和對(duì)效應(yīng)CD8+T細(xì)胞在免疫反應(yīng)中分泌顆粒酶B的靶向性。⁶⁸Ga-grazytracer比¹⁸F-FDG更敏感地區(qū)分有反應(yīng)者和無(wú)反應(yīng)者，從而在不同免疫原性的小鼠模型中，通過(guò)免疫檢查點(diǎn)封鎖治療區(qū)分腫瘤的假進(jìn)展和真進(jìn)展。在一項(xiàng)有5名患者參與的初步臨床試驗(yàn)中，注射⁶⁸Ga-grazytracer后未觀察到不良事件，接受免疫治療的癌癥患者的臨床反應(yīng)與⁶⁸Ga-grazytracer PET結(jié)果良好相關(guān)。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了⁶⁸Ga-grazytracer PET在顆粒酶B分泌相關(guān)免疫療法的臨床應(yīng)用方面的潛力，通過(guò)支持早期反應(yīng)評(píng)估和以無(wú)創(chuàng)傷和縱向的方式精確的患者分層。

實(shí)驗(yàn)方法

使用Super Nova PET/CT掃描儀(平生醫(yī)療科技有限公司)對(duì)小動(dòng)物PET進(jìn)行掃描和圖像分析。MC38, LLC, 4T1或B16OVA荷瘤小鼠在異氟烷麻醉下給予5.55 MBq ⁶⁸Ga標(biāo)記的放射性示蹤劑或¹⁸F-FDG。為了¹⁸F-FDG成像，MC38和4T1腫瘤小鼠在注射¹⁸F-FDG前禁食6小時(shí)。在注射后的指定時(shí)間(如0.5、1和2小時(shí))，進(jìn)行10分鐘靜態(tài)PET掃描。分析PET圖像，并按照前面所述計(jì)算感興趣區(qū)域(ROI)導(dǎo)出的每克組織注射劑量百分比(%ID/g)值對(duì)于假性進(jìn)展和真性進(jìn)展的腫瘤模型，MC38和4T1荷瘤小鼠腹腔注射200 μg抗PD-1(克隆RMP1-14)+ 200 μg抗CTLA-4抗體(克隆9D9;在第0、3和6天使用)。在第0天(基線)和第6天，小鼠在注射0.5或1小時(shí)后接受⁶⁸Ga-grazytracer或¹⁸F-FDG的小動(dòng)物PET成像。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

⁶⁸Ga-grazytracer在抗PD-1預(yù)處理的MC38荷瘤小鼠體內(nèi)的分布。⁶⁸Ga-grazytracer在注射0.5 h后腫瘤攝取最高，隨著時(shí)間的推移⁶⁸Ga-grazytracer腫瘤攝取下降(圖2E)。由于血液中的放射性示蹤劑被迅速清除，腫瘤與血液的比值隨著時(shí)間的推移而增加。注射后1小時(shí)腫瘤-肌肉比最高(圖2F)。體內(nèi)生物分布證實(shí)了⁶⁸Ga-grazytracer PET在體內(nèi)的結(jié)果(圖S6)。為了進(jìn)一步研究⁶⁸Ga-grazytracer PET的腫瘤攝取值是否確實(shí)能反映顆粒酶B在體內(nèi)的水平，作者對(duì)一些荷瘤小鼠進(jìn)行了⁶⁸Ga-grazytracer PET成像。老鼠PET掃描后立即實(shí)施安樂(lè)死,granzyme B表達(dá)測(cè)量腫瘤(圖2GH)。

圖2 ⁶⁸Ga-grazytracer的體內(nèi)外表征。(A)免疫治療后效應(yīng)T細(xì)胞活化和顆粒酶B (GrzmB)分泌示意圖。(B) ⁶⁸Ga-grazytracer的化學(xué)結(jié)構(gòu)。(C) ⁶⁸Ga-grazytracer與小鼠或人顆粒酶B結(jié)合的特異性(n = 5)。(D)注射64Cu-grazytracer 0.5 h后，MC38荷瘤小鼠15 μm厚的腫瘤連續(xù)切片的放射自顯影(中)和顆粒酶B免疫熒光染色(兩張)。這三個(gè)連續(xù)剖面的覆蓋區(qū)域用紅色虛線表示。規(guī)模:1毫米。數(shù)據(jù)是三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性數(shù)據(jù)。(E)注射后0.5、1和2小時(shí)，⁶⁸Ga-grazytracer在抗pd -1處理的小鼠體內(nèi)的代表性PET圖像。(F)計(jì)算⁶⁸Ga-grazytracer的腫瘤-血液和腫瘤-肌肉比值(n = 5)。(G) ⁶⁸Ga-grazytracer在MC38載瘤小鼠中的小動(dòng)物PET圖像和相應(yīng)的腫瘤攝取值(16只小鼠接受PET成像，2只因尾靜脈注射失敗而被排除)。(H)從MC38荷瘤小鼠身上提取的MC38腫瘤顆粒酶B的Western blotting(圖G)。通道在同一凝膠上運(yùn)行，但不連續(xù)。(I) PET成像定量⁶⁸Ga-grazytracer腫瘤攝取與體外western blotting測(cè)定顆粒酶B/β-微管蛋白比值的相關(guān)性(Pearson相關(guān)分析r = 0.7168)。(J) PET成像定量的⁶⁸Gagrazytracer腫瘤攝取與ELISA測(cè)定的體外顆粒酶B水平之間的相關(guān)性(Pearson相關(guān)分析r = 0.7337)。PET圖像中白色箭頭表示腫瘤。所有數(shù)值數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。**，P <0.01未配對(duì)Student t檢驗(yàn)(C)。

隨后，作者通過(guò)靶向效應(yīng)T細(xì)胞在免疫反應(yīng)中釋放的顆粒酶B，測(cè)試⁶⁸Ga-grazytracer PET是否可以用于預(yù)測(cè)動(dòng)物模型中對(duì)ICI的早期腫瘤反應(yīng)。14只MC38荷瘤小鼠在第0、3、6天使用抗PD-1抗體處理，第9天使用⁶⁸Ga-grazytracer PET(圖3A)。在治療組觀察到⁶⁸Ga-grazytracer的可變腫瘤攝取(圖3B)�？筆D-1治療組小鼠按68Ga-grazytracer腫瘤攝取值分為2組(截止值為1.45% ID/g;⁶⁸Ga-grazytracer在對(duì)照組中腫瘤攝取值最高):腫瘤攝取≥1.45% ID/g(高攝取組;平均腫瘤攝取= 2.23±0.33;腫瘤攝取范圍為1.93 ~ 2.84)，腫瘤攝取< 1.45% ID/g者(低攝取組;平均腫瘤攝取= 1.18±0.19;腫瘤攝取范圍:11 0.93 ~ 1.44;圖3 b)。監(jiān)測(cè)載藥對(duì)照組和抗PD-1治療組的腫瘤生長(zhǎng)曲線(圖3C)。第9天，高攝取組⁶⁸Ga-grazytracer的腫瘤攝取量顯著高于對(duì)照組和低攝取組(P <0.0001;圖3 d)。

圖3 ⁶⁸Ga-grazytracer的小動(dòng)物PET成像預(yù)測(cè)MC38荷瘤小鼠對(duì)抗PD-1治療的腫瘤反應(yīng)。(A)抗PD-1 (αPD-1)治療時(shí)間軸和MC38荷瘤小鼠PET成像。(B)注射后0.5h ⁶⁸Ga-grazytracer在PBS(對(duì)照)或抗PD-1處理的MC38荷瘤小鼠體內(nèi)的代表性PET圖像，腫瘤攝取高低(截止值為1.45% ID/g)。白色箭頭表示腫瘤。(C)對(duì)照組或高、低腫瘤攝取治療組的MC38荷瘤小鼠的個(gè)體腫瘤體積。(D)在第9天注射后0.5 h，每組MC38荷瘤小鼠對(duì)⁶⁸Ga-grazytracer的腫瘤攝取定量(n = 7/組)。(E) MC38荷瘤小鼠第9天和第16天的腫瘤體積(n = 7/組)。(F)流式細(xì)胞術(shù)分析描繪了CD8+ T細(xì)胞在CD45+細(xì)胞，IFN-γ+或顆粒酶B+ CD8+ T細(xì)胞中的比例，以及顆粒酶B水平從小鼠身上提取的治療后(n = 5-6 /組)。(G, H) MC38荷瘤小鼠在指定處理后的腫瘤生長(zhǎng)曲線(G)和體重曲線(H) (n = 6-8 /組)。所有數(shù)值數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。*, P < 0.05;* *, P < 0.01;* * *, P < 0.001;****，P <0.0001通過(guò)單向方差分析和事后Tukey檢驗(yàn)(D, E, F)和雙向方差分析(G)。

作者在第0天和第6天對(duì)兩種腫瘤模型進(jìn)行¹⁸F-FDG和⁶⁸Ga-grazytracer的PET成像。由于腫瘤進(jìn)展(圖4B, C)和糖代謝增加，MC38 (P <0.05)和13 4T1腫瘤(P <0.01)模型中¹⁸F-FDG的腫瘤攝取從第0天到第6天顯著增加(圖4F-I)。相反，在假性進(jìn)展的MC38腫瘤模型中，⁶⁸Ga-grazytracer的腫瘤攝取從第0天到第6天顯著增加(P <0.01，圖4F, G)。然而，在4T1小鼠荷瘤真進(jìn)展模型中沒(méi)有觀察到⁶⁸Ga-grazytracer的顯著攝取(圖4H, I)。這些結(jié)果表明，⁶⁸Ga-grazytracer PET在ICI治療第6天檢測(cè)到MC38腫瘤而不是4T1腫瘤的高顆粒酶B分泌，從而預(yù)測(cè)早期治療階段的腫瘤反應(yīng)。

圖4 ⁶⁸Ga-grazytracer PET在抗pd-1 (αPD-1)和抗ctla -4 (αCTLA-4)治療的假進(jìn)展和真進(jìn)展小鼠模型中成像。(A) MC38或4T1腫瘤模型的免疫治療和PET成像時(shí)間軸。(B, C)治療后MC38荷瘤小鼠(假性進(jìn)展)(B)和4T1荷瘤小鼠(真進(jìn)展)的個(gè)體腫瘤生長(zhǎng)曲線(C)。(D, E) MC38 (D)和4T1 (E)荷瘤小鼠治療后體重。(F, G)第0和6天假進(jìn)展MC38荷瘤小鼠¹⁸F-FDG和⁶⁸Ga-grazytracer的代表性PET圖像(F)和定量腫瘤攝取(G) (n = 8-9 /組)。(H, I)真實(shí)進(jìn)展4T1荷瘤小鼠在第0天和第6天(n = 8-9 /組)18F-FDG和⁶⁸Ga-grazytracer的代表性PET圖像(H)和定量腫瘤攝取(I)。(J)第0天和第6天收獲的MC38或4T1腫瘤組織中顆粒酶B的代表性免疫熒光染色。規(guī)模,1毫米。數(shù)據(jù)是三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性數(shù)據(jù)。PET圖像中白色箭頭表示腫瘤。所有數(shù)值數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。*, P < 0.05;**， P <0.01 by雙尾配對(duì)Student t檢驗(yàn)(G, I)。

anti-PD-1 + anti-CTLA-4組在添加或不添加FTY720時(shí)分別進(jìn)行¹⁸F-FDG和⁶⁸Ga-grazytracer PET顯像。在FTY720處理組和未處理組，¹⁸F-FDG在0 - 6天顯示相似的成像模式(圖5C, D)。相反，⁶⁸Ga-grazytracer在抗PD-1 +抗CTLA -4治療后0 - 6天內(nèi)腫瘤攝取增加。同時(shí)，antiPD-1 + anti-CTLA-4和FTY720處理后0 - 6天無(wú)顯著差異(圖5E, F)。

圖5 ⁶⁸Ga-grazytracer在免疫細(xì)胞浸潤(rùn)抑制或不抑制小鼠模型中的PET成像。(A) MC38荷瘤小鼠PET成像、抗PD -1 (αPD-1) + 抗CTLA-4 (αCTLA-4)聯(lián)合免疫治療和FTY720治療的時(shí)間軸。(B) MC38荷瘤小鼠在指定治療后的腫瘤生長(zhǎng)曲線:對(duì)照(PBS)、FTY720、αPD-1 + αCTLA-4和αPD-1 + αCTLA-4 + FTY720 (n = 6 - 9/組)(C, D)在αPD-1 + αCTLA-4治療的MC38荷瘤小鼠(n = 8-9 /組)0和6天18F-FDG的代表性PET圖像(C)和腫瘤攝取定量(D)。(E, F) ⁶⁸Ga-grazytracer在αPD-1+αCTLA-4處理的MC38載瘤小鼠(FTY720處理或不處理)第0天和第6天的代表性PET圖像(E)和定量腫瘤攝取(F) (n = 8-9 /組)。(G)流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，經(jīng)過(guò)指示性治療的小鼠腫瘤中NK1.1+細(xì)胞、CD4+ T細(xì)胞和CD8+ T細(xì)胞在CD45+細(xì)胞中的比例(n = 5/組)。PET圖像中白色箭頭表示腫瘤。所有數(shù)值數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。*, P < 0.05;* *, P < 0.01;****， P <0.0001通過(guò)雙向方差分析(B)，雙尾配對(duì)Student t檢驗(yàn)(D, F)，和雙尾不配對(duì)Student t檢驗(yàn)(G)。

與第8天相比，對(duì)照組第12天腫瘤對(duì)⁶⁸Ga-grazytracer的攝取相對(duì)沒(méi)有變化(圖6D, E)。同時(shí)，經(jīng)過(guò)WT T細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移的組，部分腫瘤在第12天對(duì)⁶⁸Ga-grazytracer的攝取增加;然而，與基線值(第8天;圖6 e)。

圖6采用過(guò)繼T細(xì)胞轉(zhuǎn)移(ACT)治療的小鼠⁶⁸Ga-grazytracer的PET成像。(A) B16 -卵白蛋白(OVA)荷瘤小鼠的PET成像和ACT示意圖。(B, C) B16-OVA荷瘤小鼠在指示性治療后的腫瘤生長(zhǎng)曲線(B)和體重(C):對(duì)照(PBS)、野生型(WT) T細(xì)胞和OT-I T細(xì)胞(n = 5-7 /組)。(D, E) B16-OVA荷瘤小鼠經(jīng)PBS或WT或OT-I小鼠的T細(xì)胞處理后第8天和第12天⁶⁸Ga-grazytracer的代表性PET圖像(D)和腫瘤攝取定量(E) (n = 5-6 /組)。白色箭頭表示腫瘤。(F)流式細(xì)胞術(shù)分析描繪了CD8+ T細(xì)胞在CD45+細(xì)胞和顆粒酶B+ CD8+ T細(xì)胞的比例，從小鼠身上提取的腫瘤治療12天后(n = 5/組)。(G) ⁶⁸Ga-grazytracer在小鼠治療后第12天的腫瘤攝取定量(n = 5-6 /組)。所有數(shù)值數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。*, P < 0.05;* *, P < 0.01;***， P <0.001的雙向方差分析(B)，雙尾配對(duì)Student t檢驗(yàn)(E)，和單向方差分析與事后的Tukey檢驗(yàn)(F, G)。

文獻(xiàn)結(jié)論

綜上所述，作者設(shè)計(jì)了一種PET示蹤劑⁶⁸Ga-grazytracer，專門靶向顆粒酶B，并監(jiān)測(cè)多種免疫療法在不同腫瘤小鼠模型中的療效。⁶⁸Ga-grazytracer在識(shí)別ICIs治療的動(dòng)物模型中腫瘤假進(jìn)展方面優(yōu)于18F-FDG。一項(xiàng)初步的臨床研究進(jìn)一步證實(shí)了⁶⁸Ga-grazytracer PET在監(jiān)測(cè)免疫治療中的作用，為未來(lái)更大隊(duì)列的臨床研究提供了理論可行性。⁶⁸Ga-grazytracer的簡(jiǎn)單合成過(guò)程使得試劑盒配方的廣泛臨床應(yīng)用成為可能，⁶⁸Ga-grazytracer PET可能提供一種通用的免疫監(jiān)測(cè)方法，能夠通過(guò)腫瘤反應(yīng)預(yù)測(cè)和患者分層指導(dǎo)精確的腫瘤免疫治療。此外，由于顆粒酶B的分泌廣泛存在于各種免疫相關(guān)疾病，⁶⁸Ga-grazytracer PET可能被證明是有效的PET腫瘤成像。

使用設(shè)備

Super Nova^® Micro PET/CT（III 代外觀圖）