利用病毒受體結合域給藥模型小鼠評價SARS-COV-2中和納米體

近日，北京大學腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所，核醫(yī)學科，國家藥監(jiān)局放射性藥物研究與評價重點實驗室，惡性腫瘤發(fā)病機制及轉化研究教育部重點實驗室，楊志主任團隊的研究成果Evaluation of SARS-CoV-2-Neutralizing Nanobody Using Virus Receptor Binding Domain-Administered Model Mice（利用病毒受體結合域給藥模型小鼠評價SARS-COV-2中和納米體）在學術期刊Research（影響因子11.036）發(fā)表。平生公司的小動物PET/CT（型號：Super Nova ）在論文中提供了重要的小鼠PET/CT圖像和定量分析。

該研究的通訊作者為楊志研究員、朱華研究員、萬亞坤教授、韓鴻賓教授。第一作者為劉松。

文獻背景

由于2019冠狀病毒病(COVID-19)的快速傳播，迫切需要開發(fā)額外的診斷工具，以進一步分析該疾病。分離到的納米體Nb11-59與嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)受體結合域(RBD)具有高親和力，可中和病毒并阻斷血管緊張素轉換酶2- (ACE2-) RBD的相互作用。在這里，作者介紹了一種新型的基于納米體的放射性示蹤劑⁶⁸Ga-Nb1159。放射示蹤劑對RBD保持高親和力，在體內外均顯示出可靠的放射化學特性。臨床前正電子發(fā)射斷層掃描(PET)研究表明，⁶⁸Ga-Nb1159在小鼠體內被快速清除，并被腎臟和泌尿系統(tǒng)攝取。幸運的是，⁶⁸Ga-Nb1159可以特異性地揭示RBD在小鼠體內的分布。本研究也有助于評估中和納米體的藥效學效應。此外，⁶⁸Ga-Nb1159可能是一個有希望的工具來探索RBD的分布和提高對該病毒的認識。特別是，本研究發(fā)現(xiàn)了一種新型的分子放射源，并建立了一種可靠的評估方法，可通過無創(chuàng)可視PET技術特異性研究RBD。

實驗方法

KM小鼠的臨床前PET/CT成像

用異氟烷麻醉(2-3%，1L/min氧氣)麻醉KM小鼠，置于加熱床上進行臨床前PET/CT掃描(Super Nova, 平生醫(yī)療科技有限公司)，然后注射⁶⁸Ga-Nb1159 200 μL。動態(tài)PET圖像采集時間為30分鐘(5分鐘/幀)。在CT圖像上繪制感興趣區(qū)域(ROIs)，并進一步在PET上繪制。采集各臟器的SUVmax，計算其動態(tài)曲線。⁶⁸GaNb1159在注射后60min和120min進行靜態(tài)PET掃描。

此外，假設一個Nb11-59螯合一個放射性核素⁶⁸Ga, ⁶⁸Ga與納米體Nb11-59的比值為0.02%。補充說明了計算過程。

RBD小鼠模型和臨床前PET成像

如方案1(b)所示，為檢測納米體Nb11-59對SARS-CoV-2的特異性，昆明小鼠(雌性，18-20 g)在右肩區(qū)PBS (40 μg、20 μg或10 μg)中注射不同劑量的SARS-CoV-2刺突RBD。作為比較，在其他小鼠的相同區(qū)域注射0.01 M PBS。將RBD和PBS代謝30分鐘，然后靜脈注射⁶⁸Ga-Nb1159, 30分鐘后使用臨床前PET按上述方案進行成像。作為比較，上述小鼠在肩區(qū)以40 μg和0 μg劑量注射RBD，并使用最常用的PET試劑¹⁸F-FDG進行評估。然后，比較RBD注射區(qū)域和對側區(qū)域的最大標準化攝取值(SUVmax)。

對Nb11-59在體內其他器官對SARS-CoV-2是否具有特異性進行了關鍵性實驗。昆明小鼠(雌性，18 ~ 20 g)氣管內接種RBD 300 μg(以100 μL PBS為單位)或0.01 M PBS (100 μL)，麻醉后腹腔注射4%水合氯醛0.2 mL。這種方法在前面中已經(jīng)描述過。靜脈注射⁶⁸Ga-Nb1159 3h;接種后30分鐘和60分鐘在相同的方案指導下進行臨床前PET成像掃描(p.i.)。比較RBD注射與0.01 M PBS注射小鼠肺SUVmax的差異。此外，以每小時60分鐘的速度去除含RBD (75 μg)和PBS的肺。然后，對左肺和右肺進行體外臨床前PET顯像，用伽馬計數(shù)器進行加權和計數(shù)。

實驗結果

臨床前PET成像研究。對初生KM小鼠的動態(tài)PET成像顯示，68Ga-Nb1159可迅速從小鼠體內清除，主要聚集在腎臟和膀胱，肝臟攝取較低(圖3(c))。雖然肝臟攝取與圖3(a)中脾臟和肺的攝取相似，但肝臟密度較脾臟和肺重。因此，在整體PET成像中，脾臟和肺的攝取遠低于肝臟(圖3(c))。動態(tài)SUVmax曲線顯示腎臟對示蹤劑的攝取較高，其次是肝臟(圖3(d))。選擇最大單體素標準化攝取值(SUVmax)，標準的核醫(yī)學度量，通過測量與患者質量和給藥活動標準化的感興趣體積(器官)的最大體素值來顯示探針在組織或器官中的積累。PET顯像顯示68Ga-Nb1159在5 min p.i.時在各器官中積累量最高，隨時間增加而減少。此外，SUVmax在20分鐘p.i后保持一致。隨后，在1小時和2小時p.i時對KM小鼠進行靜態(tài)PET成像(圖S2a)。掃描結果與30分鐘動態(tài)成像相似。結果顯示，腎臟和膀胱中積累了高水平的示蹤劑。

圖3 ⁶⁸Ga-Nb1159的體內表征。(a) ⁶⁸Ga-Nb1159注射后不同時間點在KM小鼠體內的生物分布(n = 3,20 μCi /只小鼠靜脈注射)。(b) ⁶⁸Ga-Nb1159在KM小鼠體內的藥代動力學。(c) ⁶⁸GaNb1159在KM小鼠體內30分鐘內的動態(tài)臨床前PET顯像。(d)圖3(c)動態(tài)臨床前PET顯像初始器官的SUV最大值。

在右肩注射RBD的KM模型小鼠的臨床前PET成像顯示68Ga-Nb1159在體內表現(xiàn)出對RBD的特異性(圖4(e))。該探針可以定位區(qū)域，揭示RBD的分布。與對側區(qū)域相比，rbd注射區(qū)域的68Ga-Nb1159在影像學(圖4(e))和SUVmax(圖4(a))方面均顯著增加(40 μg、20 μg和10 μg)。隨著RBD量的增加，SUVmax不斷增加(圖4(a))。此外, SUVmax與RBD量呈正相關(圖4(d))。這一相關性提示我們應該對治療性抗體治療的效果進行一定的評價。此外，成像結果與初始KM小鼠成像結果相似，包括腎臟、膀胱和肝臟的示蹤劑攝取高;其他器官的SUVmax如圖S1b所示。

圖4 RBD治療小鼠模型的臨床前PET成像及分析。(a)圖4(e) RBD注射肌肉與對側肌肉(對照組)的SUVmax比較。(b)圖S1c中RBD注射肌肉和對側肌肉(對照組)靜脈注射¹⁸F-FDG后SUVmax的比較(c)圖4(f)靜脈注射⁶⁸Ga后30分鐘和60分鐘時肺部SUVmax的比較∗∗p < 0:01，∗∗∗p ＜0.001，∗∗∗∗p＜0.0001(d) SUVmax與RBD量的相關性。(e)皮下注射RBD后給KM小鼠靜脈注射⁶⁸Ga-Nb1159的臨床前PET成像。白色箭頭表示RBD的皮下注射。(f)肺內注射RBD或0.01 M PBS后60分鐘靜脈注射KM小鼠⁶⁸Ga-Nb1159臨床前PET成像。

Nb16-68對SARSCoV-2表現(xiàn)出良好的抑制活性。用黃曲霉毒素B1檢測納米體Nb70作為陰性對照納米體。中和納米體Nb11-59和Nb16-68在本實驗中被認為是陽性對照治療納米體，因為它們能夠結合SARSCoV-2 RBD。確定藥效學作用⁶⁸Ga-Nb1159與陰性對照納米體Nb11-59或正常PBS共注射其他與SARS-CoV-2 RBD結合并用于治療病毒感染的抗體。然后，根據(jù)PET圖像計算出的SUVmax值揭示了抗體的藥效學作用，可用于防止流感大流行的進一步傳播。PET圖像如圖5(a)所示。注射Nb11-59的小鼠右肩(SARS-CoV-2 RBD注射區(qū))攝取減少。在本分析中，較好的治療效果意味著較低的PET成像SUVmax。Nb11-59共注射組SUVmax均值為0.32。相比之下，共注射陰性納米體和PBS組的SUVmax分別為0.53和0.51(圖5(b))。PET顯像顯示，PBS組的SUVmax峰值為0.62，與負納米體組(0.63)相似，超過Nb11-59組(0.45)。此外，當研究者使用該制劑注射不同劑量的Nb11-59時，SUVmax呈現(xiàn)劑量依賴性下降(當Nb11-59分別以0 mg、0.33 mg、0.57 mg和1.20 mg注射時，SUVmax分別為0.29、0.27、0.26和0.18)，如圖5(c)所示。

圖5 PBS、AFB Nb70和Nb11-59共注射小鼠的臨床前PET成像和分析。(a)皮下注射RBD后，KM小鼠靜脈注射68GaNb1159與PBS、陰性對照納米體和Nb11-59共注射臨床前PET成像。白色箭頭表示RBD的皮下注射。(b)三組小鼠共注射PBS (n = 4)、陰性對照納米體(n = 5,1mg /只小鼠靜脈注射)和Nb11-59 (n = 3,1mg /只小鼠靜脈注射)中SUVmax的比較。(c) SUVmax與Nb1159共注入量的相關性。

使用設備

                                                        Super Nova^® Micro PET/CT（III 代外觀圖）