體內(nèi)全基因組CRISPR篩選發(fā)現(xiàn)ZNF24在肺癌中是NF-κB的負調(diào)控因子

文獻信息

近日，暨南大學生命科學與技術學院生命與健康工程研究院廣東省高校功能蛋白研究重點實驗室“腫瘤分子生物學”教育部重點實驗室、首都醫(yī)科大學北京同仁醫(yī)院等單位的研究成果“In vivo genome-wide CRISPR screening identifies ZNF24 as a negative NF-κB modulator in lung cancer（體內(nèi)全基因組CRISPR篩選發(fā)現(xiàn)ZNF24在肺癌中是NF-κB的負調(diào)節(jié)因子）在雜志Cell & Bioscience（IF：9.584）上發(fā)表。平生公司的小動物活體CT（Supernova）在論文中提供了重要的小鼠肺部腫瘤圖像。

該研究的通訊作者陳良，第一作者為劉鷺。

文獻摘要

腫瘤抑癌基因(tumor suppressor genes, TSGs)的系統(tǒng)鑒定及其信號通路的闡明為理解腫瘤發(fā)生提供了一個新的角度，對肺癌患者的成功治療具有重要意義。在作者目前的工作中，通過CRISPR/Cas9介導的全基因組基因敲除進行了肺癌TSGs的體內(nèi)篩選。作者發(fā)現(xiàn)ZNF24是肺癌的有效且臨床相關的TSG。ZNF24的異位表達使肺癌細胞阻滯在S期。在機制上，ZNF24結合P65的啟動子區(qū)域，負調(diào)控其轉錄，從而負調(diào)控NF-κB的信號通路活性。這種信號級聯(lián)與臨床相關。重要的是，作者發(fā)現(xiàn)KRAS、NF-κB和PD-1的三者聯(lián)合抑制有效地減少了轉基因小鼠模型中KrasG12D/ZNF24−/−肺癌的發(fā)生。作者目前的工作揭示了ZNF24功能缺失在肺腫瘤發(fā)生中的重要作用，為部分肺癌患者的精準醫(yī)療提供了新的思路。

實驗方法

所有小鼠均在暨南大學指定的無病原體環(huán)境中飼養(yǎng)，所有實驗方案均經(jīng)暨南大學批準。所有動物工作都按照批準的規(guī)程進行。在單劑量病毒輸注實驗中，將雙轉基因小鼠的隨機分為兩組(每組3-4只)。Teton-KrasG12D/ CC10rtTA(指定KC)雙轉基因小鼠用含Dox的飼料喂養(yǎng)2個月誘導肺腺癌。過表達ZNF24的逆轉錄病毒(KC-Z)或對照(KC-C)通過鼻孔吸入肺部。小鼠恢復1周后飼喂含Dox的飼料，直至處死。用蘇木精伊紅染色肺組織。采用小動物活體CT (中國，平生醫(yī)療科技有限公司)對腫瘤負荷進行量化。

6-8周齡Lsl- KrasG12D小鼠經(jīng)鼻吸入共表達Cre和CRISPR/Cas9的重組慢病毒。在感染6個月后，通過CT監(jiān)測ZNF24敲除小鼠(K-sgZNF24小鼠)和Td-Tomato敲除小鼠(K-sgTD小鼠為對照)的T負荷。

將靶向ZNF24的sgRNA克隆到pSECC質粒中。在用于制備重組病毒之前，對合成質粒進行測序驗證。這些病毒通過鼻孔滴入到Lsl-KrasG12D小鼠體內(nèi)。肺癌誘導后6個月，通過計算機斷層掃描(Supernova CT，平生醫(yī)療科技有限公司)記錄肺負荷。用NF-κB抑制劑BAY11-7082 (selleckchem, 20 mg/kg/day)、BI3406 (selleckem, 25 mg/kg/day)和抗PD-1 (BioXcell, BP0033-2, 5 mg/kg)處理小鼠。采用CT監(jiān)測腫瘤負荷。

實驗結果

作者發(fā)現(xiàn)過表達ZNF24顯著抑制肺癌的形成(圖I, J)。檢查蘇木精和伊紅(H&E)染色的肺組織切片顯示逆轉錄病毒表達ZNF24顯著抑制KC-Z肺的腫瘤形成。

圖1 ZNF24在肺癌中是一種重要的抑癌基因。I：ZNF24表達對轉基因小鼠原位肺腫瘤形成的影響。用表達對照病毒(KC-c)或ZNF24 (KC-Z)感染Teton-KrasG12D/CC10rtTA(指定KC)小鼠，用Dox飼料喂養(yǎng)2個月。通過CT掃描和組織學切片記錄腫瘤負荷。標尺Bar = 500 μm。K：ZNF24表達對Lsl-KrasG12D小鼠腫瘤形成的影響重組慢病毒共表達Cre和CRISPR/Cas9，經(jīng)鼻吸入感染Lsl-KrasG12D。K-sgZNF24小鼠和K-sgTD小鼠感染6個月后肺腫瘤形成的比較。通過CT掃描和組織學切片記錄腫瘤負荷。標尺Bar = 500 μm。

然后，作者生成了一組K-sgZNF24肺癌小鼠，如圖1M所示，并使用BAY11-7082、BI3406和抗小鼠PD-1抗體治療這些小鼠2周（Fig.5G）. Micro-CT顯示肺腫瘤幾乎完全消退(圖G, H)。

圖5聯(lián)合抑制KRAS、NF-κB和PD-1可有效抑制Kras^G12D/ZNF24−/−肺癌。G: BAY11-7082、BI3406和PD-1抗體(指定BAY+BI+PD-1)聯(lián)合治療可有效縮小K-sgZNF24小鼠肺部腫瘤。用共表達的重組慢病毒Cre和CRISPR/Cas9經(jīng)鼻滴注處理Lsl-Kras^G12D小鼠。用BAY11-7082 (20 mg/kg/天，腹腔注射)、BI3406 (25 mg/kg/天，灌胃)和PD-1抗體(5 mg/kg，隔日一次，腹腔注射)治療小鼠。CT記錄腫瘤負荷。

文獻結論

作者的研究描述了小鼠體內(nèi)肺癌抑癌基因的全基因組篩選。結合作者的篩選結果和TCGA數(shù)據(jù)，作者發(fā)現(xiàn)ZNF24是一種新型的、有效的和臨床相關的肺癌TSG。ZNF24通過誘導S期細胞周期阻滯發(fā)揮抑癌作用。作者進一步明確了其分子機制:ZNF24結合P65啟動子區(qū)，抑制其轉錄;ZNF24抑制NF-κB通路信號通路活性及相關cyclin/CDKs的表達。ZNF24-P65-cyclin/ CDK軸與臨床相關。作者還發(fā)現(xiàn)很大一部分肺癌患者中ZNF24基因缺失。作者目前的工作揭示了ZNF24功能缺失在肺腫瘤發(fā)生中的重要作用，為部分肺癌患者的精準治療提供了新的思路。

使用設備

Micro CT（型號：Super Nova）（平生醫(yī)療科技）

             影像軟件：Avatar（平生醫(yī)療科技）