在感染條件下引導(dǎo)牙槽骨再生的非對稱膜的正空間獲取

近日，川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院化學(xué)教研室、川北醫(yī)學(xué)院口腔科&川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科、川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科和川北醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)與法醫(yī)學(xué)學(xué)院免疫學(xué)系等團隊的研究成果Positive space acquiring asymmetric membranes for guiding alveolar bone regeneration under infectious conditions（在感染條件下引導(dǎo)牙槽骨再生的非對稱膜的正空間獲�。┰趯W(xué)術(shù)期刊Biomaterials Advances（原名Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications，影響因子8.457）發(fā)表。平生公司的小動物PET/CT（型號Super Nova） 產(chǎn)品在論文中提供了重要的牙槽骨CT圖像和定量分析，把單CT系統(tǒng)的功能發(fā)揮出來，實現(xiàn)了一機兩用。

該研究的第一作者為王冰博士。

文獻摘要

為了獲得適合在感染條件下引導(dǎo)牙槽骨再生的多功能材料，作者制備了不對稱膜，包括包含成纖維細(xì)胞抑制劑聚(p-對氧環(huán)己酮- l -苯丙氨酸)(PDPA)的空間獲取層，在兩層之間形成屏障的隔離致密層和包含羥基磷灰石或羥基磷灰石&米諾環(huán)素的誘導(dǎo)成骨的靜電紡絲層。然后分析了不對稱膜的組成、結(jié)晶、形貌和親水性。米諾環(huán)素結(jié)合膜控制牙齦卟啉單胞菌(P. gingivalis)體外擴增。羥基磷灰石摻入的非對稱膜促進體外MC3T3-E1細(xì)胞成骨相關(guān)基因RUNX2、OPN、ALP的表達。羥基磷灰石不對稱膜培養(yǎng)的MC3T3-E1細(xì)胞在體外也能促進礦化。不對稱膜特別是羥基磷灰石結(jié)合膜在體內(nèi)指導(dǎo)下頜骨缺損的再生。在感染條件下引導(dǎo)的骨再生在牙齦假單胞菌感染的牙槽骨缺損模型中進行評估。具體而言，含不對稱膜的空間獲取層有效控制缺損部位結(jié)締組織增生。應(yīng)用單間隙獲取層膜獲得良好的引導(dǎo)骨再生，進一步表明積極獲取間隙對誘導(dǎo)骨再生的重要性。羥基磷灰石-米諾環(huán)素聯(lián)合對稱膜可同時抑制感染引起的牙槽骨重吸收，引導(dǎo)缺損再生。因此，羥基磷灰石-米諾環(huán)素結(jié)合的非對稱膜可能更適合用于指導(dǎo)復(fù)雜感染條件下骨缺損的再生。

實驗方法

不對稱膜的體內(nèi)成骨誘導(dǎo)作用

雄性SD大鼠24只，分為對照組、M-HA-AsM組、HA-AsM組和AsM組。戊巴比妥鈉麻醉大鼠，固定頭部后用碘伏消毒。隨機選取下頜骨的一側(cè)，切開皮膚和肌層，露出這一側(cè)的下頜骨表面。使用牙科環(huán)鉆在下頜骨產(chǎn)生一個滲透性骨缺損(⌀3mm)，并直接解剖缺損部位肌肉組織。然后，將膜(⌀5mm)放置在骨缺損兩側(cè)，面向下頜骨表面形成成骨誘導(dǎo)層。對照組在缺損部位注射0.2 mL生理鹽水，不植入任何膜。最后，在下頜缺損產(chǎn)生后立即將肌肉和皮膚逐層縫合。然后，在術(shù)后0、2、4、6或8周，對小動物使用正電子發(fā)射斷層掃描-計算機斷層掃描(PET-CT)(單CT模式，平生醫(yī)療科技昆山有限公司)監(jiān)測大鼠骨缺損再生。測定覆蓋骨缺損的骨缺損直徑和骨體積與總組織體積(3mm × 3mm × 3mm)的比值(BV/TV)。術(shù)后8周處死大鼠，取下頜骨缺損部位及周圍軟組織，用4%多聚甲醛固定。固定標(biāo)本用乙二胺四乙酸(EDTA;10%)脫鈣和石蠟包埋。采集的組織切片，用HE和馬松三色染色。

不對稱膜在體內(nèi)感染條件下引導(dǎo)牙槽骨缺損再生的作用

雄性SD大鼠30只，分為對照組和4個膜植入組。然后用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，固定鼠頭并用碘伏消毒。將大鼠上頜第一磨牙周圍的腭瓣切開并折疊。隨機選取下頜骨一側(cè)，用牙環(huán)鉆取出腭側(cè)牙槽骨(長2 mm ×寬2 mm ×深1 mm)。在鉆孔過程中，使用低溫鹽水(0.9%)沖洗手術(shù)表面，以降低鉆孔時牙槽骨的溫度。清創(chuàng)術(shù)后，將靜電紡絲膜放置于牙槽骨上方。下頜骨另一側(cè)缺損注射生理鹽水(0.2 mL)作為對照。然后使用可生物降解的材料閉合牙齦瓣，將牙齦P. gingivalis懸浮液(10 μL;1 × 107 CFU mL−1)注射到缺陷部位。每組一半大鼠在術(shù)后0、2、4、6、8周使用PET-CT掃描(單CT模式，平生醫(yī)療科技有限公司)監(jiān)測小動物感染誘導(dǎo)骨吸收和牙槽骨缺損再生的進展。確定牙槽骨缺損體積和周圍軟組織狀況。8周后對大鼠實施安樂死，取牙槽骨(包括第一磨牙及周圍軟組織)，用多聚甲醛固定(4%)，EDTA脫鈣(10%)，石蠟包埋。采集的組織切片，用HE和馬松三色染色。

實驗結(jié)果

在體內(nèi)評價M-HA-AsM、HA-AsM和AsM組對引導(dǎo)大鼠下頜骨缺損再生的影響，進一步驗證膜的成骨誘導(dǎo)作用。由于PDPA-M膜的體外成骨效果最差，且對下頜骨缺損的結(jié)締組織壓力可以忽略不計，因此未使用PDPA-M膜進行體內(nèi)成骨誘導(dǎo)實驗。如圖4所示，對照組BV/TV和最大骨缺損直徑均隨術(shù)后時間的延長而緩慢升高和降低。相比之下，膜處理組BV/TV和最大骨缺損直徑的增加和減少均快于對照組。換句話說，M-HA-AsM、HA-AsM和AsM組在不同程度上加速了骨缺損再生。在M-HA-AsM、HA-AsM和AsM組中，M-HA-AsM和HA-AsM誘導(dǎo)骨再生的效果優(yōu)于AsM，這與體外成骨誘導(dǎo)實驗結(jié)果一致。電紡成骨誘導(dǎo)層的多孔形態(tài)為成骨細(xì)胞和其他成骨相關(guān)細(xì)胞的粘附和爬行提供了支架。這促進了骨生成。因此，三種不對稱膜均促進骨缺損再生。與AsM組相比，M-HA-AsM組，尤其是HA-AsM組缺陷部位BV/TV值明顯升高，這可能與其中HA成分誘導(dǎo)成骨和導(dǎo)骨有關(guān)。M-HA-AsM誘導(dǎo)成骨的效果略弱于HA-AsM的原因可能是M-HA-AsM中的抗生素(米諾環(huán)素)略微抑制了成骨相關(guān)的細(xì)胞擴張，如圖3a所示。

因此，為了進一步研究缺損部位的骨再生情況，作者在缺損部位進行了病理相關(guān)實驗，結(jié)果如圖5所示。顯然，M-HA-AsM組和HA-AsM處理組再生骨增厚范圍更廣，這與圖4所示CT掃描圖像一致。

圖4。(a)不同膜處理大鼠下頜骨缺損的CT掃描圖像和三維重建。(b)下頜骨缺損最大直徑隨術(shù)后時間的變化(*表示與對照組比較P < 0.05)。(c)測量下頜骨缺損部位的BV/TV，并繪制成術(shù)后時間的函數(shù)圖(*表示與對照組相比P < 0.05)

圖6a為不同膜處理的牙槽骨缺損CT掃描重建的三維圖像。圖6b為術(shù)后8周三個方向的二維CT圖像。圖6c為CT掃描重建三維圖像所得牙槽骨缺損體積的統(tǒng)計分析結(jié)果。圖6d為術(shù)后8周CT掃描重建的軟組織3D圖像。除M-HA-AsM治療組外，其余各組大鼠術(shù)后2周內(nèi)牙槽骨重吸收明顯，如圖6a和c所示。這一結(jié)果表明，對照組和HA-AsM、AsM、PDPA-M治療組大鼠牙周炎在2周內(nèi)進展迅速。因此，M-HA-AsM組通過聯(lián)合抗生素米諾環(huán)素有效阻斷牙周炎的形成和發(fā)展。

此外，圖6b所示的結(jié)果顯示，在術(shù)后8周，對照組和AsM治療組大鼠牙根間隙存在廣泛的骨再吸收，但M-HA-AsM、HA-AsM和PDPA-M治療組大鼠牙根間隙或牙根未觀察到明顯的牙槽骨再吸收。這表明對照組和AsM治療組牙周炎進展和感染誘導(dǎo)的骨重吸收在8周后仍未修復(fù)。

除AsM治療組大鼠外，其余實驗組大鼠均出現(xiàn)牙槽骨缺損體積開始增加的現(xiàn)象兩周后略有恢復(fù)。提示急性細(xì)菌感染期后骨缺損已恢復(fù)。經(jīng)膜處理的大鼠恢復(fù)情況均優(yōu)于對照組。這說明所有的膜都能在一定程度上支持成骨細(xì)胞的擴散或成骨分化。HA-AsM組大鼠牙槽骨恢復(fù)最多，AsM組大鼠牙槽骨恢復(fù)最少，甚至在術(shù)后6周開始恢復(fù)。這說明M-HA-AsM、HA-AsM和PDPA-M具有較好的牙周炎抑制和骨再生誘導(dǎo)作用。

特別是PDPA-M組(含有一個抑制纖維化的PDPA層)能很好地引導(dǎo)骨再生。結(jié)締組織增生(尤其是炎癥刺激增生)嚴(yán)重?fù)p害牙齦部位牙槽骨缺損的再生，是牙周炎患者骨再生的主要障礙。為了更清晰地觀察結(jié)締組織增生，根據(jù)不同實驗部位的CT掃描重建軟組織三維圖像，如圖6d所示。顯然，對照組和AsM治療組結(jié)締組織致密增生性。雖然骨缺損沒有完全修復(fù)，但PDPA-M處理組沒有出現(xiàn)明顯的增生性結(jié)締組織，M-HA-AsM和HA-AsM處理組出現(xiàn)了一些松散的增生性結(jié)締組織。正如作者之前的研究所證明的那樣，當(dāng)PDPA共聚物降解時，L-Phe(抑制成纖維細(xì)胞膨脹)被釋放出來，纖維結(jié)締組織增生可以被抑制。PDPA- M是一種可快速降解的多孔單層PDPA膜。另外三種膜均為多層復(fù)合膜，其中疏水PLGA/PLCA隔離層的加入降低了膜的親水性，減緩了PDPA層的降解。因此，纖維化抑制M-HA-AsM、HA-AsM和AsM的正向空間獲取效應(yīng)均弱于PDPA-M。在M- HA-AsM組、HA-AsM組和AsM組中，AsM的親水性最差，其抑制纖維化的效果最差。

圖6所示  (a)用不同膜處理的牙槽骨缺損的CT掃描重建的3D圖像。(b)不同膜治療牙槽骨缺損術(shù)后8周CT掃描圖像。(c)牙槽骨缺損體積隨術(shù)后時間的變化(*表示與對照組比較P < 0.05)。(d)術(shù)后8周手術(shù)部位軟組織CT掃描重建3D圖像。

文獻結(jié)論

為了指導(dǎo)感染條件下的牙槽骨缺損再生，制備和評估了不對稱膜。米諾環(huán)素聯(lián)合M-HA-AsM體外抑制牙齦假單胞菌增殖。HA-AsM和PDPA-M支持MC3T3-E1細(xì)胞體外增殖。由于M-HA-AsM釋放二甲胺四環(huán)素，在培養(yǎng)后期對MC3T3-E1細(xì)胞有輕微的細(xì)胞毒性。由于M-HA-AsM和HA-Asm含有成骨誘導(dǎo)HA，在體外可促進MC3T3- E1細(xì)胞的成骨分化和礦化。這些膜，特別是M-HA-AsM和HA-AsM，在體內(nèi)指導(dǎo)下頜骨缺損的再生。在感染條件下，在牙齦假單胞菌感染的牙槽骨缺損模型中評估骨缺損再生指導(dǎo)。所有膜均引導(dǎo)牙槽骨缺損再生。由于其低生物相容性，AsM表現(xiàn)出最差的綜合骨修復(fù)。具體而言，M-HA-AsM、HA-AsM和PDPA- m在缺陷部位有效抑制結(jié)締組織增生，抑制纖維化，PDPA層表現(xiàn)出正空間獲取功能。利用PDPA-M獲得良好的骨再生指導(dǎo)，進一步表明積極獲取空間對誘導(dǎo)骨再生的重要性。此外，不對稱HA-AsM誘導(dǎo)骨再生效果最好，因為HA-AsM同時具有誘導(dǎo)成骨和獲得正空間的功能。在牙齦P. gingivalis感染的大鼠模型中，M-HA-AsM的牙周炎誘導(dǎo)骨再生能力略低于HA-AsM。盡管由于米諾環(huán)素的加入，M-HA-AsM仍然抑制了進進式牙槽骨吸收，因此可能更適合在復(fù)雜的感染條件下應(yīng)用。

使用設(shè)備

                                               Super Nova^® Micro PET/CT  II代產(chǎn)品（平生醫(yī)療科技）

                                                             影像軟件：Avatar（平生醫(yī)療科技）