DAP-seq技術(shù)在棉花體細胞胚胎發(fā)生（SE）研究中的應(yīng)用

體細胞胚胎發(fā)生（Somatic embryogenesis, SE）可以不經(jīng)過配子融合，由體細胞分化發(fā)育成整個植株。SE是一個多因素的發(fā)育過程，也是研究細胞全能性的理想模型。目前，SE在多個領(lǐng)域得到了應(yīng)用，例如：種質(zhì)保護、人工種子生產(chǎn)、單倍體育種、無性繁殖，以及作為植物生物技術(shù)研究領(lǐng)域的平臺工具。然而，目前對SE調(diào)控機制的理解僅限于少數(shù)模式植物（例如：擬南芥），而且不同物種之間SE調(diào)控機制存在很大差異。因此，深入研究重要經(jīng)濟作物棉花的SE調(diào)控機制對棉花育種和繁殖具有重要的意義。

2023年7月11日，鄭州大學(xué)與中棉所棉花生物學(xué)國家重點實驗室的研究成果發(fā)表在New Phytologist（IF=9.4，Q1區(qū)）期刊上，題目為“GhRCD1 regulates cotton somatic embryogenesis by modulating the GhMYC3-GhMYB44-GhLBD18 transcriptional cascade”。該研究使用DNA親和純化測序(DAP-seq)技術(shù)鑒定了陸地棉GhMYC3的結(jié)合基序和靶基因。揭示了GhRCD1-GhMYC3-GhMYB44-GhLBD18轉(zhuǎn)錄級聯(lián)調(diào)控棉花SE的分子機制，為細胞全能性以及棉花基因工程研究提供了新思路。

1. GhMYC3是棉花SE過程中一個重要的調(diào)控因子

通過序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析，在陸地棉中篩選到一個與Homo-MYC具有高度系統(tǒng)發(fā)育相似性的同源基因GhMYC3，具有1個bHLH和1個bHLH-MYC_N結(jié)構(gòu)域。于是假設(shè)GhMYC3在決定細胞命運方面具有與人類MYC相似的生理功能。

為研究GhMYC3對SE過程中細胞命運轉(zhuǎn)變的影響，構(gòu)建了過表達GhMYC3的棉花轉(zhuǎn)基因系（OE-GhMYC3）。表型分析發(fā)現(xiàn)過表達GhMYC3顯著誘導(dǎo)了SE，促進愈傷組織生長。隨后，GhMYC3的RNAi細胞系（Ri-MYC3）表型分析發(fā)現(xiàn)Ri-GhMYC3與WT的愈傷組織形成率一致，但新鮮愈傷組織的重量（FW）略輕，胚性愈傷組織（EC）分化率顯著降低。以上結(jié)果表明，GhMYC3促進棉花體細胞向愈傷組織的去分化，但阻止了向EC的轉(zhuǎn)變過程。

GhMYC3調(diào)控棉花SE過程

(a) 智人、陸地棉、擬南芥中MYC蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析。(b) 棉花SE過程示意圖。下胚軸作為外植體，用愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)，體細胞去分化形成愈傷組織，在60-90天的生長過程中，增殖的愈傷組織重新分化為EC，EC發(fā)育成體細胞胚，而后在體細胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上萌發(fā)為幼苗。(c) WT、OE-GhMYC3、Ri-GhMYC3在EC分化過程中的形態(tài)差異。(d) 長日照下生長的WT、OE-GhMYC3、Ri-GhMYC3植株葉片組織中GhMYC3的相對表達量。(e) WT、OE-GhMYC3、Ri-GhMYC3愈傷組織的FW。(f) WT、OE-GhMYC3、Ri-GhMYC3的EC分化率。

2. GhMYC3直接與GhMYB44和GhLBD18的啟動子結(jié)合，調(diào)控其表達

DAP-seq分析鑒定了GhMYC3的DNA結(jié)合基序及其下游靶基因。鑒于愈傷組織形成和根系生長具有共同的調(diào)控途徑，作者鑒定到了與根系發(fā)育和生長素信號通路有關(guān)的2個靶基因GhMYB44和GhLBD18。亞細胞定位分析發(fā)現(xiàn)GhMYC3、GhMYB44和GhLBD18主要表達于細胞核。在GhMYB44和GhLBD18的啟動子中存在與GhMYC3結(jié)合的G-box（CACGTT）元件。酵母單雜交（Y1H）和電泳遷移率（EMSA）實驗驗證了GhMYC3特異性地結(jié)合GhMYB44和GhLBD18啟動子中的G-box基序。另外，煙草葉片瞬時表達分析發(fā)現(xiàn)GhMYC3以G-box依賴的方式激活GhLBD18的轉(zhuǎn)錄，抑制GhMYB44的轉(zhuǎn)錄。

GhMYC3直接結(jié)合并調(diào)控GhMYB44和GhLBD18的轉(zhuǎn)錄

(a) GhMYC3的結(jié)合序列在基因組上的分布。(b) GhMYC3的主要結(jié)合基序CA T/C GT T/G。(c) GhMYC3下游基因的GO富集分析。(d) GhMYB44和GhLBD18啟動子序列中包含G-box基序。(e) Y1H實驗。(f) EMSA實驗。(g-h) 煙草葉片瞬時表達分析及LUC熒光強度統(tǒng)計。

3. GhMYB44與GhLBD18的啟動子直接相互作用，抑制其表達

DAP-seq分析發(fā)現(xiàn)在GhLBD18啟動子中存在MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。Y1H和EMSA實驗驗證了GhMYB44與GhLBD18啟動子的直接結(jié)合。瞬時基因表達分析表明GhMYB44通過直接結(jié)合GhLBD18的啟動子序列抑制其表達。以上結(jié)果表明，GhMYC3除了通過與GhLBD18啟動子特定位點結(jié)合直接激活GhLBD18的表達外，還通過GhMYB44-GhLBD18轉(zhuǎn)錄級聯(lián)信號間接調(diào)控GhLBD18的表達。

4. GhMYB44通過GhLBD18調(diào)控SE過程

利用OE-GhMYB44、SRDX-GhMYB44（特異性沉默系）和OEGhLBD18棉花株系進一步研究MYB44調(diào)控SE的過程。與WT相比，在OE-GhMYB44中愈傷組織起始延緩，愈傷組織增殖減弱，EC分化加速；相反，在SRDX-GhMYB44和OE-GhLBD18中愈傷組織起始提前，愈傷組織增殖增強，EC分化延遲。因此，GhMYB44在GhLBD18的上游發(fā)揮作用，在愈傷組織起始、愈傷細胞增殖和愈傷組織向EC的轉(zhuǎn)變過程中控制細胞命運的決定。

5. GhRCD1與GhMYC3相互作用調(diào)節(jié)SE過程

采用酵母雙雜交（Y2H）鑒定到在SE過程中與GhMYC3互作的蛋白GhRCD1，該蛋白在愈傷組織和EC形成的不同階段均被誘導(dǎo)，但在體細胞胚中保持較低水平。雙分子熒光互補（BiFC）實驗、Pull down實驗、LUC互補實驗證明了GhMYC3與GhRCD1蛋白有相互作用。GhRCD1的敲除突變體（KO-GhRCD1）和過表達轉(zhuǎn)基因系（OE-GhRCD1）實驗分析發(fā)現(xiàn)，與WT相比KO-GhRCD1表現(xiàn)出愈傷組織起始提早，生長加快，F(xiàn)W增加；而與WT和KO-GhRCD1相比，OE-GhRCD1表現(xiàn)為愈傷組織起始延遲，增殖減少，EC分化率降低。結(jié)果表明，RCD1的適當(dāng)表達對SE過程至關(guān)重要，但RCD1的過表達或突變均不利于愈傷組織細胞的命運轉(zhuǎn)變過程。

GhRCD1與GhMYC3有相互作用

(a) Y2H實驗。(b) BiFC實驗。(c) Pull down實驗。(d) LUC互補實驗。(e-g) KO-GhRCD1和OE-GhRCD1在SE不同發(fā)育階段的形態(tài)學(xué)分析(e)、FW分析(f)和EC分化率分析(g)。

6. GhRCD1拮抗GhMYC3調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄能力

使用雙熒光素酶報告（Dual-luc）實驗檢測GhRCD1是否影響GhMYC3對其下游靶點的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。將LUC報告基因分別與GhMYB44和GhLBD18啟動子融合，再通過瞬時轉(zhuǎn)染測定啟動子活性。GhMYC3的過表達抑制了GhMYB44啟動子驅(qū)動的LUC表達，但過表達GhRCD1削弱了這種抑制作用；GhMYC3增強了GhLBD18啟動子驅(qū)動的LUC表達，而過表達GhRCD1削弱了這種增強作用。此外，GhMYB44能夠直接抑制GhLBD18的表達，但GhMYB44和GhMYC3共表達導(dǎo)致GhLBD18啟動子驅(qū)動的LUC表達水平顯著高于單獨表達GhMYB44，這表明GhMYC3直接干擾了GhMYB44對GhLBD18的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。qRT-PCR檢測結(jié)果表明GhMYB44的表達水平與GhMYC3的表達呈負相關(guān)。GhLBD18在OE-GhMYC3和SRDX-GhMYB44中表達上調(diào)，而在Ri-GhMYC3細胞系中表達下調(diào)�？傊�，在SE過程中GhRCD1抑制GhMYC3對GhMYB44和GhLBD18的表達調(diào)控能力。

7. 由RCD1-MYC3-MYB44-LBD18級聯(lián)介導(dǎo)的活性氧穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)細胞命運轉(zhuǎn)變

利用ROS熒光探針H₂DCF和BCIP-NBT檢測SE不同發(fā)育階段的ROS積累，發(fā)現(xiàn)ROS最初在外植體階段的損傷組織中增加，細胞內(nèi)ROS水平與愈傷組織細胞增殖呈正相關(guān)，第21 d時在發(fā)育的愈傷組織中觀察到氧化爆發(fā)。在EC發(fā)育過程中，ROS在愈傷組織的胚性前區(qū)富集，但在其他部位枯竭。過表達GhMYC3和GhLBD18導(dǎo)致ROS積累，促進愈傷組織細胞增殖，然而過表達GhMYB44則相反。最后，該研究提出了一個愈傷組織形成和SE的模型。在下胚軸外植體培養(yǎng)的不同發(fā)育階段，GhRCD1、GhMYC3、GhMYB44和GhLBD18的表達水平與細胞命運決定和細胞分化動態(tài)緊密相關(guān)。這些基因的精確時空表達可調(diào)節(jié)細胞內(nèi)ROS的積累，進而影響SE過程中的細胞命運轉(zhuǎn)變。

GhRCD1-GhMYC3-GhMYB44-GhLBD18信號級聯(lián)調(diào)控SE的機制模型圖

在愈傷組織誘導(dǎo)過程中，GhMYC3通過調(diào)控GhMYB44和GhLBD18的轉(zhuǎn)錄，進一步激活ROS依賴的信號通路，使ROS優(yōu)先在誘導(dǎo)部位積累，并在愈傷組織增殖過程中達到峰值。在EC獲得過程中，較高水平的GhRCD1可能抑制GhMYC3對GhMYB44和GhLBD18的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，從而相應(yīng)地減少ROS的積累，而且ROS在EC周圍呈極性分布。

本文小結(jié)：該研究揭示了SE過程中細胞命運轉(zhuǎn)變的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。GhMYC3通過結(jié)合GhMYB44和GhLBD18啟動子中的G-box元件調(diào)節(jié)其表達。GhRCD1拮抗GhMYC3對下游靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控能力。GhRCD1-GhMYC3-GhMYB44-GhLBD18組成的轉(zhuǎn)錄級聯(lián)模塊呈現(xiàn)時序表達模式，并時序性的調(diào)節(jié)細胞內(nèi)ROS穩(wěn)態(tài)，進而影響SE過程中細胞的命運。

參考文獻：Yuan J, Liu X, Zhao H, Wang Y, Wei X, Wang P, Zhan J, Liu L, Li F, Ge X. GhRCD1 regulates cotton somatic embryogenesis by modulating the GhMYC3-GhMYB44-GhLBD18 transcriptional cascade. New Phytol. 2023. doi: 10.1111/nph.19120. (IF=10.323)

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