機械應(yīng)變誘導(dǎo)乳腺癌細胞表型變化并促進腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制

乳腺腫瘤微環(huán)境（TME）內(nèi)的機械力是癌癥進展的有效調(diào)節(jié)因子。隨著乳腺腫瘤的生長，各種生物力學(xué)在TME中積累，造成了腫瘤內(nèi)部的壓縮增加，外圍張力增加以及整個腫瘤體積的間質(zhì)液流動改變的復(fù)雜情況，這些力通過調(diào)控侵襲和轉(zhuǎn)移級聯(lián)影響癌癥進展。此外，研究表明，生物力學(xué)力通過癌細胞-免疫細胞信號串?dāng)_調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。

盡管TME內(nèi)存在多種細胞-細胞信號傳導(dǎo)機制，但外泌體在調(diào)節(jié)腫瘤進展中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，可以通過調(diào)節(jié)免疫細胞活性來促進癌細胞免疫逃逸，從而促進易于腫瘤發(fā)展的環(huán)境。此外，研究表明，生物力學(xué)力可能具有通過TME內(nèi)外泌體介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)直接或間接調(diào)節(jié)細胞成分的潛力。

有幾種仿生體外系統(tǒng)可用于確定機械力對癌細胞的影響。微流體和Transwell系統(tǒng)通過調(diào)節(jié)趨化因子和蛋白質(zhì)表達提供了對血流介導(dǎo)的乳腺癌（BCa）細胞信號傳導(dǎo)的見解。其他采用壓縮的體外系統(tǒng)已顯示，BCa細胞響應(yīng)壓縮力通過細胞骨架重排增強其遷移。恒定張力下的三陰性乳腺癌（TNBC）細胞系通過FAK-Rho-ERK介導(dǎo)的信號增強其增殖和侵襲潛力。雖然這些體外研究已經(jīng)解決了恒定流量或恒定細胞張力如何直接影響癌細胞，但尚未解決這些機械力是否有助于體內(nèi)免疫抑制。此外，惡性BCa細胞中的機械力，外泌體釋放和免疫反應(yīng)之間的直接聯(lián)系尚未得到研究。

來自美國阿拉巴馬大學(xué)伯明翰分校醫(yī)學(xué)系、病理學(xué)系、機械工程系課題組的一項研究曾報告了機械應(yīng)變能明顯改變BCa細胞的蛋白質(zhì)組學(xué)特征并能增強外泌體的產(chǎn)生，所產(chǎn)生的外泌體能夠直接促進惡性腫瘤細胞的生長，并誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制及改變免疫細胞的極化。相關(guān)研究成果發(fā)表在Laboratory Investigation期刊，題為“Mechanical strain induces phenotypic changes in breast cancer cells and promotes immunosuppression in the tumor microenvironment”。
 

 

振蕩應(yīng)變促進BCa細胞增殖和遷移

首先，為了確定體外機械應(yīng)變是否調(diào)節(jié)BCa細胞的增殖，利用體外張力系統(tǒng)，參數(shù)為0.3 Hz，10%單軸振蕩應(yīng)變（Oscillatory strain，OS） 48小時，10% 恒定應(yīng)變（Constant strain，CS）48小時，或無應(yīng)變48小時，然后將MCF-7細胞（人ER+），MDA-MB-231細胞（人TNBC）和4T1.2細胞（小鼠TNBC）暴露于恒定或振蕩應(yīng)變，并評估細胞增殖。結(jié)果表明，暴露于OS的MCF-7細胞與對照細胞或CS細胞相比增殖增加（圖1 a）。與對照細胞相比，暴露于CS和OS下的MDA-MB-231和4T1.2細胞的增殖都有所增加（圖1 b-c）；暴露于OS增強了ER+和TNBC（人和小鼠）細胞的遷移潛力（圖1 d-f）；暴露于CS僅增加人TNBC細胞的Transwell遷移和傷口愈合（圖1 e）。這些數(shù)據(jù)表明，振蕩應(yīng)變促進ER+和TNBC細胞的增殖和遷移。
 

圖1   BCa細胞的增殖和遷移響應(yīng)機械應(yīng)變而變化。

機械應(yīng)變改變BCa細胞產(chǎn)生的外泌體

為了研究機械應(yīng)變是否調(diào)節(jié)BCa細胞的外泌體產(chǎn)生，將MCF-7細胞、MDA-MB-231細胞和4T1.2細胞暴露于OS 48小時，并從條件培養(yǎng)基中分離腫瘤來源的外泌體（TEXs）。 結(jié)果表明，OS暴露的人和小鼠TNBC細胞的條件培養(yǎng)基中的外泌體濃度顯著高于對照細胞，而OS不會改變ER+ 細胞的TEX產(chǎn)生，而且外泌體之間的平均大小在組間沒有顯著差異。此外，外泌體濃度與暴露于OS后在人和小鼠TNBC細胞中觀察到的增殖增加呈正相關(guān)。

目前尚不清楚增加的外泌體產(chǎn)量是否導(dǎo)致更高的增殖，或者更高的增殖是否導(dǎo)致外泌體的產(chǎn)生增加。為了解決這個問題，進行了共培養(yǎng)實驗，將暴露或不暴露于OS 48小時的 MCF-7細胞，MDA-MB-231細胞和4T1.2細胞在存在或不存在源自癌細胞外泌體的情況下共培養(yǎng)，評估細胞增殖。結(jié)果沒有觀察到與來自對照細胞的外泌體共培養(yǎng)和與來自暴露于OS癌細胞的外泌體共培養(yǎng)之間的癌細胞增殖顯著差異。因此，外泌體產(chǎn)生的增加不會導(dǎo)致更高的增殖，這表明更高的增殖可能導(dǎo)致研究中注意到的外泌體產(chǎn)生的增加。

 

振蕩應(yīng)變改變BCa細胞的免疫調(diào)節(jié)外泌體譜

Tetraspanins、CD63、CD81、CD9 和 ESCRT-I 復(fù)合物亞基TSG101 是公認的標志物，可共同識別來自其他類型細胞外囊泡（EVs）的外泌體。暴露于OS的MCF-7細胞釋放的TEXs的表征顯示CD63+ 外泌體的頻率增加，CD81+ 外泌體的頻率降低。人和小鼠TNBC細胞產(chǎn)生的外泌體的Tetraspanin譜沒有顯著變化。此外，免疫調(diào)節(jié)蛋白（如免疫檢查點PD-L1）和賦予外泌體侵襲潛力的蛋白（如EpCAM和CD54）在外泌體上的存在開始在促進免疫抑制、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移方面受到重視。當(dāng)評估這些標志物時，暴露于OS的小鼠4T1.2細胞CD81+ PD-L1+ 和CD63+ PD-L1+ 外泌體的數(shù)量增加，而CD63+ CD54+ 外泌體的數(shù)量降低。這些發(fā)現(xiàn)表明，振蕩應(yīng)變調(diào)節(jié)TNBC細胞產(chǎn)生PD-L1+ 外泌體。

 

振蕩應(yīng)變促進TNBC原位模型中的腫瘤生長

接下來，為了確定OS是否促進體內(nèi)腫瘤生長，利用BCa的同源原位小鼠模型來監(jiān)測腫瘤大小和免疫細胞的浸潤。如圖2 a，與移植未應(yīng)變的細胞相比，移植4T1.2細胞的小鼠暴露于OS在第8天和第11天顯示腫瘤生長顯著增加。

由于異質(zhì)性髓源性抑制細胞（MDSC）和腫瘤相關(guān)巨噬細胞具有腫瘤促進功能，并且是腫瘤相關(guān)免疫抑制的驅(qū)動因素，因此進一步研究了機械應(yīng)變誘導(dǎo)的腫瘤細胞變化是否改變了乳腺TME以調(diào)節(jié)這些免疫抑制細胞的浸潤，從而進一步促進腫瘤生長。腫瘤組織的免疫分析顯示，移植4T1.2細胞的小鼠暴露于OS在第14天TME中單核細胞MDSC亞群的百分比顯著增加（圖2 b）。腫瘤浸潤性粒細胞在兩組間的 MDSC 亞群無差異（圖2 c）。此外，移植4T1.2細胞的小鼠暴露于OS后TME中募集的巨噬細胞的浸潤增加（圖2 d）。值得注意的是，CD8+ T細胞的百分比在這些小鼠的TME中顯示出下降的趨勢（圖2 e）。這些結(jié)果表明，振蕩應(yīng)變通過TME中的免疫抑制促進腫瘤生長。

 

圖2   振蕩力促進體內(nèi)TME中的腫瘤生長和免疫抑制。

 

振蕩應(yīng)變通過TME中的免疫抑制細胞調(diào)節(jié)外泌體的內(nèi)化

然后進一步研究腫瘤細胞來源的外泌體是否被免疫細胞內(nèi)化以調(diào)節(jié)體內(nèi)的免疫抑制。結(jié)果表明，在乳腺腫瘤細胞上應(yīng)用OS不僅可以增強腫瘤細胞-外泌體的分泌，還可以通過MDSCs和募集的巨噬細胞內(nèi)化TEXs促進MDSCs和巨噬細胞的浸潤，從而調(diào)節(jié)TME中的免疫抑制。

 

TME中免疫細胞和腫瘤細胞的外泌體內(nèi)化

最后研究了TEXs是否被TME中的免疫細胞和腫瘤細胞內(nèi)化。在注射外泌體后的第2天（圖3 a）和第8天（圖3 a），TME中免疫細胞內(nèi)化的外泌體被鑒定為PKH67+ CD45+ 細胞，而腫瘤細胞內(nèi)化的外泌體被鑒定為PKH67+ CD45 陰性細胞（圖3 b）。此外，在外泌體注射后第2天和第8天，在TME中檢測到各種免疫細胞的外泌體內(nèi)化，包括募集的巨噬細胞（圖3 c）、M2巨噬細胞（圖3 d）、MDSCs（圖3 e-g）、 CD4+ T 細胞 （圖3 h）和CD8+ T細胞（圖3 i）。在外泌體+ 細胞中，MDSCs的頻率高于其他研究的免疫細胞群。這些結(jié)果表明，TEXs可以被TME中的免疫細胞和腫瘤細胞在體內(nèi)內(nèi)化。

 

圖3    TME中免疫細胞和腫瘤細胞內(nèi)化外泌體。

總之，該研究的數(shù)據(jù)表明，暴露于機械應(yīng)變會增強BCa細胞中的侵襲性和促腫瘤表型，從而通過改變腫瘤細胞的增殖和遷移潛力以及增加免疫抑制細胞內(nèi)化的免疫調(diào)節(jié)外泌體的釋放來促進免疫抑制，從而促進TME中增強的免疫-腫瘤細胞串?dāng)_。進一步研究參與腫瘤進展的機械應(yīng)力的潛在機制的努力可能為靶向TME提供新的治療方法。

參考文獻：Wang Y, Goliwas KF, Severino PE, Hough KP, Van Vessem D, Wang H, Tousif S, Koomullil RP, Frost AR, Ponnazhagan S, Berry JL, Deshane JS. Mechanical strain induces phenotypic changes in breast cancer cells and promotes immunosuppression in the tumor microenvironment. Lab Invest. 2020 Dec;100(12):1503-1516. doi: 10.1038/s41374-020-0452-1. Epub 2020 Jun 22. PMID: 32572176; PMCID: PMC7686122.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32572176/

 

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