深度解析曠場實(shí)驗(yàn)的發(fā)展、原理及應(yīng)用

一、背景和歷史概述 

曠場測試（OFT）是一種常用的測量嚙齒動(dòng)物探索行為和一般活動(dòng)的方法，其中可以測量活動(dòng)的質(zhì)量和數(shù)量。Hall被廣泛認(rèn)為是首次引入OFT的人。雖然最初的研究是在大鼠中進(jìn)行的，但OFT也在小鼠中得到了廣泛的應(yīng)用。除了總移動(dòng)距離，還分析了移動(dòng)的許多特性。這些包括在墻壁（觸壁性）和中心的時(shí)間，不同時(shí)間段的移動(dòng)距離，以及后腿直立。此外，OFT有時(shí)被用作評(píng)估一般活動(dòng)水平的“控制”實(shí)驗(yàn)，用于涉及活動(dòng)的其他行為測試。

OFT也常用于評(píng)估化合物的鎮(zhèn)靜、毒性或刺激效果。因此，該測試有許多用途，幾乎包含在對(duì)嚙齒動(dòng)物行為的每一次全面分析中。主要來說，曠場（OF）是一個(gè)圍場，通常是方形、矩形或圓形，周圍有防止逃逸的墻壁（圖1.1）。因此，OFT通常不使用“場”這個(gè)詞的真正意義，即一個(gè)寬闊、開闊的區(qū)域，動(dòng)物可以在其中移動(dòng)和行為自如，而是一個(gè)曠場，對(duì)于小鼠來說，通常會(huì)從25平方厘米變化到超過250平方厘米。雖然有一些例外，但在幾乎所有的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，小鼠都是由研究者放入曠場的，因此被迫與新環(huán)境互動(dòng)。在解釋結(jié)果時(shí)應(yīng)考慮這種強(qiáng)制進(jìn)入，因?yàn)閯?dòng)物并不主動(dòng)尋求進(jìn)入曠場。傳統(tǒng)的OFT持續(xù)時(shí)間在2到10分鐘之間。這段短時(shí)間強(qiáng)調(diào)了探索行為和對(duì)新奇事物的反應(yīng)，而不是基線活動(dòng)。這段短時(shí)間（在早期研究中使用）是由于許多原因，包括手動(dòng)獲取數(shù)據(jù)的方法。更近期的方法，包括視頻跟蹤和通過紅外線束斷裂次數(shù)的跟蹤，允許更高的吞吐量和更長時(shí)間的監(jiān)控。
 

圖1 曠場箱模型 

移動(dòng)距離、移動(dòng)時(shí)間、后腿直立和活動(dòng)隨時(shí)間的變化都是可以計(jì)算和報(bào)告的測量。還有許多其他不常報(bào)告的測量，包括不移動(dòng)的時(shí)間、嗅探、發(fā)聲和牙齒打顫（參見Walsh和Cummins（7）對(duì)OFT依賴性測量的全面審查）。最近，特別是隨著高吞吐量方法的出現(xiàn)和對(duì)行為研究中單一結(jié)果的關(guān)注，報(bào)告的變量數(shù)量通常有所減少。然而，已經(jīng)有努力包括可以由計(jì)算機(jī)系統(tǒng)評(píng)估的許多變量，包括飛奔、路徑的紋理、活動(dòng)密度和包括倫理測量和常規(guī)變量的主成分分析�？偟膩碚f，我們?cè)谶@一章中并沒有詳細(xì)討論這些不常監(jiān)測的結(jié)果。此外，我們也沒有詳細(xì)討論進(jìn)行因子分析或定義因子之間關(guān)系的方法。

最基本和常見的關(guān)注結(jié)果是“運(yùn)動(dòng)”，然而，這可能受到運(yùn)動(dòng)輸出、探索驅(qū)動(dòng)、僵直（或其他恐懼相關(guān)行為）、疾病、晝夜周期中的相對(duì)時(shí)間以及其他各種變量的影響。重要的是，曠場測試（OFT）（尤其是單次短時(shí)間測試）并不是基線或自發(fā)活動(dòng)的準(zhǔn)確代理，這只能通過在鼠類適應(yīng)的環(huán)境中或在家庭籠中進(jìn)行更長時(shí)間的監(jiān)測來測量。同樣，OFT不僅僅是運(yùn)動(dòng)活動(dòng)的測量，而且涉及到其他因素，如探索驅(qū)動(dòng)（好奇心）和恐懼（或焦慮）。大多數(shù)老鼠會(huì)傾向于在靠近墻壁的地方花費(fèi)大部分時(shí)間，這種現(xiàn)象被稱為觸壁性。OFT最初開始作為一個(gè)新奇性測試，然后，如果測試持續(xù)足夠長的時(shí)間，可以測量一般活動(dòng)。在早期暴露期間，焦慮可能在一般活動(dòng)和觸壁性方面都起作用，后來更多的只在觸壁性方面起作用。因此，雖然OFT越來越被用作測量一般運(yùn)動(dòng)活動(dòng)的代理，但這是一個(gè)忽視了許多不同方面對(duì)OFT行為的貢獻(xiàn)的趨勢。

關(guān)于OFT在何種程度上是情緒性的可靠測量，已經(jīng)有過討論。一些結(jié)果，特別是排便、中心時(shí)間和前5分鐘內(nèi)的活動(dòng)，可能測量了情緒性的某些方面。OFT中的早期活動(dòng)可以測量焦慮，因?yàn)樗�可能引發(fā)分離壓力（因?yàn)閯?dòng)物被從其籠伴隔離）和廣場恐懼癥（暴露于大型曠場與熟悉的標(biāo)準(zhǔn)鞋盒式保持籠完全不同）。典型的OFT的布局也與嚙齒類動(dòng)物在野外通常的生活方式形成對(duì)比：在社交網(wǎng)絡(luò)、地下洞穴或保護(hù)區(qū)域中。此外，中心時(shí)間通常對(duì)γ-氨基丁酸（GABA）作用的抗焦慮藥（在大多數(shù)情況下是苯二氮卓類藥物）的急性給藥敏感，但通常被認(rèn)為對(duì)短期或長期的SSRIs治療不敏感。然而，這可能取決于品系和劑量，許多現(xiàn)有的研究已經(jīng)在大鼠中進(jìn)行。作為與這一總體發(fā)現(xiàn)沖突的數(shù)據(jù)的一個(gè)例子，Dulawa等人已經(jīng)顯示，長期在飲用水中給予18和25 mg/kg/day的氟西汀，但不是10 mg/kg/day，導(dǎo)致BALB/cJ小鼠中心入口數(shù)的增加。然而，對(duì)單胺作用抗焦慮藥的一般不敏感性，嚙齒類動(dòng)物的自然習(xí)性和傾向，以及其他證據(jù)，已經(jīng)導(dǎo)致了中心時(shí)間可能測量“正常”焦慮并對(duì)嚴(yán)重的“病理性”焦慮不敏感的建議，如在一些人類疾病中所見。

在曠場內(nèi)的小鼠運(yùn)動(dòng)可以使用許多不同的機(jī)制進(jìn)行監(jiān)測。歷史上，第一種方法依賴于在曠場的表面標(biāo)記出水平和垂直的平行線（或者在圓形曠場的情況下有時(shí)是同心的），形成一個(gè)網(wǎng)格。觀察者（無論是現(xiàn)場的還是通過視頻錄制的）記錄鼠從網(wǎng)格的一個(gè)方塊跨越到另一個(gè)方塊的次數(shù)，也記錄是否進(jìn)入中心或周邊方塊。第二種機(jī)制涉及使用紅外傳感器，通常也是放在兩個(gè)方向上。傳感器也可以放在第三個(gè)維度（高度）上，以監(jiān)測抬起或頭部下沉（如果曠場包括一個(gè)洞口地板）。最后一個(gè)常見的機(jī)制涉及使用視頻攝像頭和軟件進(jìn)行頂部跟蹤（圖1.2），可以從包括Noldus（Ethovision；荷蘭）、上海欣軟（VisuTrack，中國上海）和Stoelting Co（ANY-maze；，USA）在內(nèi)的許多供應(yīng)商那里獲得。

圖1.2   大小鼠曠場實(shí)驗(yàn)箱 型號(hào)XR-XZ301，上海欣軟                       

2.設(shè)備、材料和設(shè)置 

2.1. 房間

隔離聲音和無意的干擾。如果有環(huán)境噪音變化的擔(dān)憂，可以使用白噪音機(jī)器（例如，白噪音發(fā)生器，San Diego Instruments，San Diego, CA, USA 或者聲音療法機(jī)器，Conair Corporation, Glendale, AZ, USA）。

曠場地的一致照明。如在“實(shí)驗(yàn)變量”中討論的，不同的研究者使用的照明量差異很大，可以是紅色或白色。作為經(jīng)驗(yàn)法則，我們的實(shí)驗(yàn)室通常使用大約30勒克斯的暗光。更亮的光（尤其是更亮的白光）可能會(huì)增加觸墻性和/或減少運(yùn)動(dòng)，但在明亮的環(huán)境中進(jìn)行測試并不少見。無論選擇何種光線級(jí)別，研究者都應(yīng)使用光度計(jì)記錄光線級(jí)別，并在任何出版物中報(bào)告此級(jí)別。

2.2. 曠場材料

任何材料，包括塑料、金屬或木頭，都可以用來構(gòu)建曠場。塑料或耐腐蝕金屬更可取，因?yàn)檫@些材料可以輕松清潔和消毒。大小可以大不相同（見實(shí)驗(yàn)變量）。使用的既有矩形也有圓形的曠場。矩形曠場的優(yōu)點(diǎn)是可以更容易地將多個(gè)曠場放入一個(gè)測試房間。圓形曠場則消除了老鼠在角落里待的選項(xiàng)。對(duì)于簡單的活動(dòng)測量，大多數(shù)大小都會(huì)提供合理的數(shù)據(jù)。如果還在測量其他參數(shù)，特別是觸墻性，那么更大的場地可能會(huì)提供更準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)（推薦至少40 * 40厘米的大�。�。墻高應(yīng)至少為35厘米。這個(gè)高度既限制了老鼠看到墻外的能力，也通常足夠高，除非在極端情況下，可以防止老鼠跳出曠場。最常見的是在裸地上測試?yán)鲜蟆Ｈ欢�，一些�?shí)驗(yàn)室在薄薄的床鋪上進(jìn)行測試。許多協(xié)議要求在老鼠之間徹底清潔，盡管其他程序在動(dòng)物之間保持床鋪。還有其他協(xié)議只移除糞便和尿液，因?yàn)檩p微但一致的嗅覺線索比任何殘留的消毒劑味道更可取。我們提供了一種在老鼠之間用消毒劑輕度清潔的協(xié)議；然而，無論選擇何種方法，最重要的是在自己的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)外保持一致。如果使用頂部視頻跟蹤系統(tǒng)，考慮使用啞光地板以防止反射。

2.3. 獲取數(shù)據(jù)的方法

如前所述，這可以手動(dòng)完成，如果曠場地被劃分為不同的區(qū)域（圖2.1）。更常見的是在配備有光電池的曠場中進(jìn)行測試，或者動(dòng)物被計(jì)算機(jī)化跟蹤軟件監(jiān)控。

2.4. 計(jì)時(shí)器 這可以由設(shè)備或數(shù)字跟蹤軟件自動(dòng)化，也可以是單獨(dú)的手持計(jì)時(shí)器。

2.5. 測試后的新鼠籠

通常，將老鼠放入新籠子比放回其籠伴侶那里更可取，因?yàn)橹匦乱�入老鼠可能�?huì)修改尚未測試的老鼠的行為。

2.6. 清理材料

通常包括一個(gè)垃圾桶和紙巾來清理尿液和擦拭曠場。一個(gè)小而安靜的手持式吸塵器通常很適合清除緊湊的糞便。

2.7. 消毒劑 一個(gè)裝有10-70%酒精的噴霧瓶可以用于一般擦拭。注意，酒精應(yīng)謹(jǐn)慎使用，因?yàn)樗�可能�?huì)導(dǎo)致許多塑料裂紋，并溶解用于將塑料和其他材料粘合在一起的膠水。

3. 實(shí)驗(yàn)流程

任何類型的新奇或壓力都可能改變探索行為。因此，減少新奇，例如籠子的變化，對(duì)于測試前的一段時(shí)間至關(guān)重要，通常至少24小時(shí)。同樣重要的是，所有要在一組內(nèi)進(jìn)行比較的動(dòng)物在其生命中都以相同的方式處理。應(yīng)盡一切可能減少背景壓力，并確保所有處理都是隨機(jī)的。程序?qū)⒃趯?shí)驗(yàn)室之間變化，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，老鼠可能只被測試一次或多次以評(píng)估對(duì)濫用藥物的適應(yīng)性或敏感性。歷史上，OFT通常在5或10分鐘內(nèi)進(jìn)行。這個(gè)時(shí)間段的一個(gè)原因是活動(dòng)是手動(dòng)評(píng)分的，一次一個(gè)動(dòng)物。新的系統(tǒng)是自動(dòng)化的，允許動(dòng)物在任何一個(gè)時(shí)間點(diǎn)在多個(gè)曠場中單獨(dú)測試。在我們的實(shí)驗(yàn)室，我們通常在60分鐘的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行OFT。這使我們能夠評(píng)估初次接觸期間的探索活動(dòng)和通常在曠場的新奇消退后，通常是接觸開始后的30分鐘，看到的一般活動(dòng)。

3.1 在測試前至少1小時(shí)將老鼠運(yùn)送到測試室，讓老鼠適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。如果轉(zhuǎn)移涉及到環(huán)境變化過大或其他可能的壓力源，這個(gè)時(shí)間段應(yīng)該延長。

3.2打開視頻攝像機(jī)、光電檢測設(shè)備或其他跟蹤系統(tǒng)。注意，無論使用何種數(shù)據(jù)采集方法，最好的做法是使用視頻攝像機(jī)記錄每個(gè)會(huì)話。這樣，如果有必要，可以在以后的時(shí)間重新評(píng)估會(huì)話的結(jié)果。

3.3清潔曠場地（OF）。即使在初始試驗(yàn)之前曠場地并不臟，清潔也很重要，這樣所有的動(dòng)物都能平等地體驗(yàn)到消毒劑的殘留氣味。

3.4將老鼠放入曠場地。最常見的是將老鼠放在中心。然而，有時(shí)也會(huì)將老鼠放在靠近墻壁的地方，這是因?yàn)檫@樣不會(huì)立即將老鼠暴露在壓力情境（曠場地的中心）中，或者因?yàn)檫@樣可能更容易到達(dá)（在曠場地面積大的情況下）。

3.5啟動(dòng)計(jì)時(shí)器。

3.6測試者應(yīng)該離開房間，或者盡可能遠(yuǎn)離曠場和老鼠的視線。在每次試驗(yàn)中，測試者應(yīng)保持靜止和安靜。

3.7在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將老鼠從曠場中移出，并放入新的籠子。

3.8計(jì)數(shù)糞便。如前所述，糞便的數(shù)量與動(dòng)物的情緒或焦慮狀態(tài)有關(guān)。糞便數(shù)量的增加與其他焦慮度量相關(guān)。

3.9用消毒劑清潔曠場地（如果使用了吸塵器的話）。

3.10在將下一只老鼠放入曠場地之前，等待消毒劑完全干燥。

系統(tǒng)的類型，以及在一定程度上曠場地的大小，將決定可以可靠測量的參數(shù)的類型和數(shù)量。對(duì)于手動(dòng)跟蹤，這通常包括穿過的方格數(shù)、在中心方格中花費(fèi)的時(shí)間、后腿立起的次數(shù)和糞便。對(duì)于自動(dòng)系統(tǒng)，可以測量的參數(shù)數(shù)量似乎無窮無盡。然而，通常最有用的結(jié)果是移動(dòng)的距離（無論是真實(shí)距離測量還是相對(duì)單位）、移動(dòng)的時(shí)間、在中心的時(shí)間、垂直活動(dòng)和糞便。通常，計(jì)算這些輸出在整個(gè)時(shí)間段（例如，總移動(dòng)距離），并根據(jù)測量，也分為時(shí)間區(qū)間。例如，每5分鐘移動(dòng)的距離是呈現(xiàn)和分析數(shù)據(jù)的常見方法。實(shí)驗(yàn)的主要結(jié)果通常被視為連續(xù)變量，并根據(jù)比較的組數(shù)或?qū)嶒?yàn)條件的數(shù)量，使用t檢驗(yàn)或方差分析（ANOVA）進(jìn)行分析。分箱數(shù)據(jù)（例如，1小時(shí)內(nèi)每5分鐘移動(dòng)的距離）應(yīng)通過兩因素ANOVA進(jìn)行分析，時(shí)間為一個(gè)因素，處理（或基因型等）為另一個(gè)因素。

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