轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)調(diào)控mRNA亞型的原理及實(shí)驗(yàn)步驟

Cell頂級(jí)期刊：BluePippin+LRS（Long-read sequencing）揭示轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)調(diào)控mRNA亞型的機(jī)制
 

 

近日，來(lái)自德國(guó)馬普研究所的Valerie Hilgers團(tuán)隊(duì)在頂級(jí)期刊《Cell》上上發(fā)表了題為Sites of transcription initiation drive mRNA isoform selection的文章，揭示了在mRNA可變剪接過(guò)程中，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSSs）通過(guò)表觀遺傳方法調(diào)控多聚腺苷酸位點(diǎn)（PASs）的詳細(xì)分子機(jī)制。
 

在mRNA合成過(guò)程中，任何一步出現(xiàn)變異都會(huì)影響成熟轉(zhuǎn)錄本的編碼區(qū)和非編碼區(qū)�？勺兗艚樱ˋS）和選擇性多聚腺苷酸化（APA）可以產(chǎn)生不同編碼區(qū)（CDS）或者不同長(zhǎng)度3'端非編碼區(qū)（3'UTR）的mRNA�？勺�3'UTR區(qū)通過(guò)調(diào)控相關(guān)microRNA轉(zhuǎn)錄本和RNA結(jié)合蛋白（RBPs）互作的序列和結(jié)構(gòu)元件，繼而調(diào)控編碼蛋白的豐度、定位以及蛋白復(fù)合體的組裝。而APA則依據(jù)環(huán)境不同、基因不同以及細(xì)胞類型不同來(lái)調(diào)節(jié)蛋白功能。APA參與多種細(xì)胞過(guò)程，廣泛影響細(xì)胞功能。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤和神經(jīng)紊亂在內(nèi)的許多人類疾病都與APA失調(diào)有關(guān)。

APA的組織或環(huán)境特異性調(diào)控，是通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子或RBPs等效應(yīng)物的活性所介導(dǎo)的。在不同細(xì)胞環(huán)境下，轉(zhuǎn)錄延伸因子和轉(zhuǎn)錄終止因子與可變剪切和多聚腺苷酸化（CPA, the cleavage and polyadenylation）機(jī)制的相互作用，可以增強(qiáng)或抑制mRNA 3'端的加工。然而，APA的基因特異性調(diào)控機(jī)制尚不清晰，雖然已有多項(xiàng)研究表明啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控可能與APA相關(guān)聯(lián)，但是轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）是否會(huì)影響poly(A) 位點(diǎn)（PASs）的選擇仍然未知。研究人員期待更多方法幫助挖掘轉(zhuǎn)錄起始、可變剪接、APA、3'UTR區(qū)之間的調(diào)控關(guān)系。

上述關(guān)于轉(zhuǎn)錄起始、剪接和終止位點(diǎn)選擇的調(diào)控機(jī)制研究，面臨的主要挑戰(zhàn)是如何將單個(gè)轉(zhuǎn)錄本的不同區(qū)域相互關(guān)聯(lián)。特別是同一mRNA中相距幾千堿基的5'端和3'端。到目前，該領(lǐng)域仍沒(méi)有能夠確定單個(gè)轉(zhuǎn)錄本的完整起始和終止位點(diǎn)、并完成測(cè)序的方法。這阻礙了對(duì)轉(zhuǎn)錄起始和終止之間調(diào)控關(guān)系的系統(tǒng)分析。而傳統(tǒng)LRS測(cè)序文庫(kù)片段通常分布在1-2 kb，其獲得的mRNA亞型長(zhǎng)短不一且不具代表性，還會(huì)存在5'或3'端的堿基偏差。由于無(wú)法獲取完整的全長(zhǎng) mRNA 亞型，也就無(wú)法量化同一基因的不同 TSS 對(duì)3'端序列的影響。
 

本研究中，結(jié)合Sage Science公司BluePippin全自動(dòng)DNA片段回收儀，開發(fā)了一個(gè)研究策略Combined Isoform Assembly（CIA）來(lái)準(zhǔn)確評(píng)估和量化長(zhǎng)或者超長(zhǎng)mRNA異構(gòu)體，顯著提升mRNA亞型發(fā)掘效率和質(zhì)量（圖1）。以果蠅大腦組織（具有豐富的mRNA多樣性以及超長(zhǎng)mRNA）為例，使用BluePippin富集＞3kb的DNA片段，顯著提升read長(zhǎng)度（圖2），從而提升read的完整轉(zhuǎn)錄本覆蓋率（圖3、4）。

圖1 mRNA亞型組裝流程


圖2. 使用BluePippin 進(jìn)行片段選擇后顯著增加了ONT cDNA的read長(zhǎng)度（A），并優(yōu)化了神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄本的回收，其長(zhǎng)度（B）超過(guò)了沒(méi)有進(jìn)行片段選擇的LRS實(shí)驗(yàn)的覆蓋范圍（灰色）


圖3. 不同組織使用不同LRS測(cè)序獲得read長(zhǎng)度分布情況。BluePippin片段選擇后（下圖中的紅色圖表）顯著提高了全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的覆蓋率
 

圖4. 在片段篩選之前（上圖）和之后（下圖），果蠅頭部的納米孔測(cè)序cDNA和PacBio Iso-seq的每個(gè)read的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本覆蓋率，篩選后有顯著提升（對(duì)于每個(gè)read，顯示所覆蓋的目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本的分?jǐn)?shù)；根據(jù)目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本的長(zhǎng)度對(duì)讀數(shù)進(jìn)行分組）
 

從分析結(jié)果來(lái)看，通過(guò) BluePippin片段篩選后，獲得的轉(zhuǎn)錄本3'端堿基分布更具真實(shí)性，沒(méi)有過(guò)多的A堿基背景噪音（圖5A）。且獲得的轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度/數(shù)量遠(yuǎn)高于先前注釋的轉(zhuǎn)錄本（圖5B）。借助BluePippin全自動(dòng)片段回收儀，CIA策略生成了果蠅mRNA亞型圖譜，產(chǎn)生了59970個(gè)高置信度的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本，其中包含多個(gè)新的mRNA亞型，顯著提升mRNA亞型發(fā)掘效率和質(zhì)量。

 

圖5.（A）被丟棄3'端堿基序列與CIA方法獲取3'端堿基序列比較（B）隨著獲取轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度增加，新轉(zhuǎn)錄本數(shù)量也急劇攀升

在不同的細(xì)胞中，通常是通過(guò)可變剪切產(chǎn)生不同的mRNA亞型來(lái)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)和功能。本研究評(píng)估了轉(zhuǎn)錄起始、可變剪切和3'末端位點(diǎn)選擇之間的調(diào)控關(guān)系。借助長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序（LRS）精確獲取超長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的兩端序列，明確果蠅組織中的mRNA亞型數(shù)量，特別是轉(zhuǎn)錄情況復(fù)雜的神經(jīng)系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)，在果蠅頭部以及人類大腦器官中，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)廣泛影響3'末端位點(diǎn)的形成。“顯性啟動(dòng)子”具有特定的表觀遺傳特征如p300/CBP結(jié)合，其通過(guò)施加轉(zhuǎn)錄限制來(lái)決定剪接和多聚腺苷化類型。體內(nèi)“顯性啟動(dòng)子”缺失或過(guò)表達(dá)以及p300/CBP的缺失，都會(huì)改變了3'末端的序列。研究表明，TSS的選擇對(duì)轉(zhuǎn)錄本多樣性和組織特性的調(diào)控具有重要影響。
 

​​Alfonso-Gonzalez, Carlos, et al. "Sites of transcription initiation drive mRNA isoform selection." Cell 186.11 (2023): 2438-2455.
 

 

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