Nature Protocols文獻(xiàn)解析：“腸-腦軸”靶向代謝組學(xué)研究的創(chuàng)新方法

如果你要寫腸道，就不能只寫腸道。你要寫胃腸道居住著大約5億個神經(jīng)元組成的腸神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生人體50%的多巴胺和約90%的5-羥色胺影響你的情緒；你要寫超過100萬億個微生物組成的腸道菌群產(chǎn)生的神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸幫你控制恐懼和焦慮；你要寫腸道包含70%的人體免疫細(xì)胞幫你免疫各種病原體的侵害；你要寫人體的“第二大腦”腸腦軸（Gut-Brain Axis）……

近期很多腸腦軸的研究人員詢問繪譜君，通過微生物擴(kuò)增子測序、宏基因組、代謝組學(xué)，篩到了與疾病關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵細(xì)菌和代謝物，后續(xù)如何設(shè)計實驗進(jìn)一步確定因果關(guān)系？

2023年一篇發(fā)表在Nature Protocols“基于LC-MS/MS的靶向代謝組學(xué)，通過體外細(xì)菌和類器官培養(yǎng)及體內(nèi)無菌小鼠模型，對哺乳動物腸-腦軸進(jìn)行研究”的文章給出了研究范式。動物模型在探究大腦和腸道間的雙向交流中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，但目前大部分研究都集中在復(fù)雜的微生物群落上，很難確定特定微生物對宿主神經(jīng)系統(tǒng)的貢獻(xiàn)。作者借助靶向代謝組學(xué)、細(xì)菌培養(yǎng)、體外（類器官）和體內(nèi)小鼠模型解析共生微生物和宿主復(fù)雜代謝物評估的系統(tǒng)化策略；該方法可專門識別微生物信號 (體外和體內(nèi))并將它們與宿主內(nèi)部的變化相關(guān)聯(lián)。

哪些微生物驅(qū)動宿主代謝物的改變？

胃腸道中有一個豐富多樣的微生物群落，統(tǒng)稱為腸道菌群。腸道微生物群包括厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、變形菌門和疣微菌門等。腸道菌群在嬰兒出生后不久就會形成，并隨著宿主年齡的增長而波動。在發(fā)育早期，嬰兒期腸道通常以放線菌門的雙歧桿菌為主，微生物和宿主在這個重要窗口期之間的相互作用被推測對中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的正常發(fā)育至關(guān)重要。青春期后，腸道微生物群被認(rèn)為是穩(wěn)定的，主要是細(xì)菌門和厚壁菌門。這些衰老過程中成分的變化代表了飲食、環(huán)境和潛在的宿主需求的良性循環(huán)。除了維持腸道環(huán)境外，人們逐漸認(rèn)識到其對其他遠(yuǎn)端器官的影響。過去十年，研究人員已經(jīng)認(rèn)識到胃腸道和大腦之間重要的雙向聯(lián)系即“腸-腦”軸。腸道微生物通過多種途徑與大腦進(jìn)行交流：細(xì)菌代謝物（如短鏈脂肪酸（SCFAs）和肽聚糖）、神經(jīng)遞質(zhì)（如γ-氨基丁酸（GABA）、組胺）、色氨酸代謝、腸內(nèi)分泌細(xì)胞激活、免疫調(diào)節(jié)及刺激腸神經(jīng)系統(tǒng)（ENS）和迷走神經(jīng)。腸道微生物群與焦慮、肥胖、自閉癥、精神分裂癥、帕金森病和阿爾茨海默氏癥的密切聯(lián)系體現(xiàn)其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)健康中的作用。哪些微生物驅(qū)動了宿主特定中樞神經(jīng)系統(tǒng)的改變？

基于LC-MS/MS代謝組學(xué)方法利用體外（培養(yǎng)基和類器官模型）和體內(nèi)（單個微生物定植的無菌小鼠）系統(tǒng)檢測細(xì)菌代謝物，定量宿主來源的神經(jīng)遞質(zhì)和SCFAs。本文選擇兩種人類腸道中常見的齒雙歧桿菌和卵形擬桿菌結(jié)合培養(yǎng)基、類器官和已知菌動物解析單個微生物對宿主神經(jīng)遞質(zhì)的影響，以明確特定的細(xì)菌如何改變腸道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)。

方法步驟概述

1. 微生物模型的工作流程

特定細(xì)菌如何改變腸道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)？研究不同類型微生物組模型的一般工作流程由三部分組成：

階段1. 使用培養(yǎng)基生成微生物代謝物來識別微生物來源的神經(jīng)遞質(zhì)和SCFAs（步驟1-24）；

階段2. 利用小鼠或人類類器官體外研究微生物代謝物對腸上皮的影響，確定產(chǎn)生神經(jīng)遞質(zhì)的腸內(nèi)分泌細(xì)胞對細(xì)菌產(chǎn)物的反應(yīng)（步驟25-47）；

階段3. 體內(nèi)研究，使用單個微生物定植的已知菌小鼠進(jìn)行體內(nèi)研究，以確定腸道和大腦如何對微生物定植做出反應(yīng)（步驟48-52）。

圖1. 不同類型微生物組模型的一般工作流程

2. 各樣品收集方法和前處理步驟

（步驟53-56）介紹采集糞便樣本、安樂死、收集和處理各種組織的過程，包括腦組織（步驟57-69）、腸道內(nèi)容物（步驟70-79）和糞便（步驟80-86）。

（1）代謝物的無細(xì)胞微生物條件培養(yǎng)基（步驟9-14用于微生物培養(yǎng)和條件微生物培養(yǎng)基處理，步驟87B（i-iii）用于色氨酸、酪氨酸途徑和谷氨酸循環(huán)分析，步驟87A（i-v）用于培養(yǎng)基中SCFA分析）；

（2）含代謝物的無細(xì)胞微生物條件培養(yǎng)基注射類器官培養(yǎng)基（步驟25-47）；

（3）腸道沖洗（步驟53-54、56和70-79）；

（4）腦勻漿（步驟53-54、56和57-69）；

（5）糞便樣本（步驟53-55、80-86和附87A（i-ii）和（vi-viii），用于均質(zhì)糞便樣本提取物中的SCFA分析）。

圖2. 各樣品采集方法和處理步驟

3. LC-MS/MS靶向代謝組學(xué)方法優(yōu)化

因液相色譜分離具有廣泛的色譜柱選擇和優(yōu)異的分離技術(shù)（如反相（±離子配對），親水交互色譜（HILIC），和離子交換、手性和正相色譜），使用單一的MS儀器平臺可以覆蓋多種物理化學(xué)性質(zhì)的微生物和宿主產(chǎn)生的代謝物�；�于LC-MS/MS的靶向代謝組學(xué)工作流程使用三重四極桿質(zhì)譜檢測，標(biāo)準(zhǔn)品和同位素內(nèi)標(biāo)（IS）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行高精度和準(zhǔn)確的定量。圖3a突出顯示了神經(jīng)遞質(zhì)的代謝途徑及使用LC-MS/MS方法檢測這些途徑生成的相應(yīng)色譜圖。圖3b確定了SCFA分析物的衍生化前和衍生化后的化學(xué)結(jié)構(gòu)及用于衍生化反應(yīng)的試劑。

色氨酸和酪氨酸途徑代謝物的定量方法基于反相離子色譜分離，使用含有七氟丁酸的流動相。谷氨酸循環(huán)法基于HILIC，使用含有甲酸銨和甲酸的流動相進(jìn)行流動相緩沖。最后，SCFA方法利用π-π疊加交互聯(lián)苯的芳香功能分析柱和芳香環(huán)的衍生品產(chǎn)生的衍生化反應(yīng)分離所有SCFA衍生物。

作者對SCFA、色氨酸、酪氨酸途徑和谷氨酸循環(huán)靶向代謝組學(xué)方法進(jìn)行一維方法基準(zhǔn)評估，即使沒有酪氨酸、色氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和乙酸的培養(yǎng)基仍表現(xiàn)出高化學(xué)背景，干擾幾種代謝物的定量。本研究制備一種可以培養(yǎng)多組生物體的明確培養(yǎng)基且可用于SCFA和神經(jīng)遞質(zhì)的分析，如ZMB1中SCFA和神經(jīng)遞質(zhì)的分析。ZMB1是一種培養(yǎng)各種微生物（雙歧桿菌，擬桿菌，鏈球菌，乳酸桿菌，乳球菌，梭狀芽胞桿菌等）的培養(yǎng)基，并適用于LC-MS/MS的代謝組學(xué)分析。

圖3. 部分代謝途徑和LC-MS/MS色譜圖

實驗設(shè)計

1. 微生物代謝物的產(chǎn)生

細(xì)菌可以從供應(yīng)商處購買(如美國培養(yǎng)收集(ATCC)， DSM德國微生物收集)或從臨床環(huán)境中獲得。每次實驗應(yīng)使用分光光度計檢查600nm (OD600nm)處的光密度，并使用40×或60×物鏡在顯微鏡上檢查微生物形態(tài)，以監(jiān)測微生物的生長。微生物應(yīng)定期進(jìn)行革蘭氏染色和選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)的污染檢測。建議在厭氧室中培養(yǎng)厭氧菌，兼性厭氧菌可以在好氧或低氧條件下生長(如帶有厭氧氣體生成小袋或蠟燭罐的容器系統(tǒng)中; 兼性厭氧菌表達(dá)的特定代謝途徑可能受到其培養(yǎng)的大氣條件的影響。對于厭氧微生物，必須預(yù)先還原化學(xué)成分明確的培養(yǎng)基以支持其生長。為了使各組之間的微生物代謝物標(biāo)準(zhǔn)化，建議收集無細(xì)胞微生物條件培養(yǎng)基，其包含在相同培養(yǎng)基中產(chǎn)生的代謝物，在相同的孵育條件下，在特定的細(xì)菌生長階段，通過OD600nm隨時間監(jiān)測。

2. 微生物選擇，小鼠菌株，定殖驗證和體內(nèi)研究的樣品收集

單相關(guān)克隆小鼠產(chǎn)生需要的GF動物設(shè)施和選擇感興趣的細(xì)菌是實驗設(shè)計的關(guān)鍵部分。腸道微生物幾乎都在GF小鼠體內(nèi)定植。然而，微生物在非天然宿主中的定殖效率可能會有所不同，需要定期檢查微生物的定殖狀態(tài)以確保成功定殖，建議從隔離器內(nèi)的籠子中收集糞便，提取基因組DNA并通過PCR確認(rèn)所選微生物的存在。糞便微生物可以在選擇性瓊脂上生長，并檢查集落形成單位(CFU)，以確認(rèn)定植和活力。最后，糞便可直接進(jìn)行16S核糖體RNA測序確認(rèn)微生物譜。

實驗小鼠品系選擇：成功定殖雄性和雌性成年Swiss-Webster和C57B6/J小鼠并對品種進(jìn)行優(yōu)化。選擇小鼠模型時應(yīng)考慮某些微生物可能無法在不同遺傳背景的小鼠或老年小鼠中定植。本實驗選擇產(chǎn)仔量大，培育能力強(qiáng)的遠(yuǎn)交Swiss Webster GF小鼠，近親繁殖的小鼠遺傳變異增加，基因敲除/敲入模型可用于近交系如C57BL/6J。因此，選擇哪種小鼠品系最能解決感興趣的科學(xué)問題至關(guān)重要。

微生物定殖時間：本研究用牙芽孢桿菌或卵形芽孢桿菌定殖17天的成年無菌小鼠（圖4），建議每組至少4只小鼠進(jìn)行初步研究，以確定定植水平與神經(jīng)遞質(zhì)和SCFA濃度變化的穩(wěn)健性。

糞便是否凍干：從動物組收集的糞便顆粒重量大致相同，糞便樣本的含水量沒有被去除，因此在分析代謝物之前建議通過凍干去除水分。在腹瀉情況下，從糞便中去除水分可能很重要。但糞便凍干的弊端是樣品基質(zhì)中揮發(fā)性SCFA的潛在損失。因此，僅在糞便重量預(yù)計在組間有變化的情況下對糞便進(jìn)行凍干。

3. 腸道類器官和培養(yǎng)形式的選擇

由腸道干細(xì)胞產(chǎn)生的組織來源的類器官可以分化為與它們來源的胃腸道部分相關(guān)的所有細(xì)胞類型。例如，從結(jié)腸中收集的活檢或組織將包含干細(xì)胞、腸內(nèi)分泌細(xì)胞、腸細(xì)胞和杯狀細(xì)胞。從小腸（十二指腸、空腸或回腸）收集的活檢或組織將包含干細(xì)胞、腸內(nèi)分泌細(xì)胞、腸細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、潘氏細(xì)胞和簇狀細(xì)胞。使用類器官系統(tǒng)的優(yōu)勢在于保留了其片段的特異性，并且片段在細(xì)胞類型、轉(zhuǎn)運體、粘蛋白分泌、激素分泌和功能方面存在差異。類器官可以來自于各種動物（老鼠、豬、牛、馬等）和人類。綜上該系統(tǒng)提供了比較多個物種、在小鼠和人類之間進(jìn)行直接比較的能力，腸道類器官也可以由具有特定疾病表型的個體產(chǎn)生，因此腸道類器官有多種應(yīng)用優(yōu)勢。

小鼠和人腸道類器官可以在3D或2D中培養(yǎng)，3D形式是最容易培養(yǎng)腸道類器官的，并且類器官向內(nèi)的管腔可以微注射微生物或微生物代謝物來模擬腸道環(huán)境。該顯微注射平臺已被證明可以在3D類器官模型中創(chuàng)建穩(wěn)定的厭氧微生物群落。為了避免對顯微注射的要求，可以在傳代后將微生物添加到類器官培養(yǎng)中。傳代會破壞類器官結(jié)構(gòu)，當(dāng)類器官重組時，微生物被困在管腔內(nèi)。然而很難控制每個類器官所接收到的微生物負(fù)荷相同。微生物或代謝物也可以添加到3D類器官的外側(cè)但可能不會產(chǎn)生生物學(xué)上相關(guān)的信號級聯(lián)。類器官可以在基質(zhì)外培養(yǎng)，類器官固有地逆轉(zhuǎn)其結(jié)構(gòu)，暴露在頂端表面。在這種情況下，微生物或微生物代謝物可以直接添加到培養(yǎng)基中，并與頂膜相互作用，這種“由內(nèi)而外”的方法非常適合于研究兼性厭氧菌和微生物代謝物。

4. 類器官研究優(yōu)勢

大多數(shù)使用小鼠檢測腸腦軸的研究都使用具有完整腸道菌群的SPF小鼠。然而，腸道菌群的復(fù)雜性使這些研究難以解釋。本研究基于LC-MS/MS分析用單一微生物物種定植的已知菌動物模型中的腸道和腦神經(jīng)遞質(zhì)及SCFA，能夠解決特定微生物對腸道和大腦的影響問題。

涉及微生物-宿主互作的研究隨著類器官培養(yǎng)的進(jìn)步正逐步擴(kuò)大。類器官，又稱類腸或類結(jié)腸，來源于供體腸道組織，與傳統(tǒng)的癌癥來源或永生化細(xì)胞系相比，具有幾個關(guān)鍵優(yōu)勢：（1）保留區(qū)段特異性；（2）所有腸細(xì)胞類型的表達(dá)；（3）產(chǎn)生腸粘液層；（4）干細(xì)胞的維持；（5）激素分泌。使用類器官模型可以剖析微生物和宿主上皮之間的信號傳導(dǎo)如關(guān)注上皮腸內(nèi)分泌激素。本方案的體外技術(shù)可用于原代類器官（從組織部位分離），多能干細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞的類器官及其生成的多種組織類型如胃腸道和大腦類器官，類器官還可以從健康個體或特定患者群體產(chǎn)生，適合解決與微生物-宿主互作相關(guān)的研究問題。

靶向代謝組學(xué)方法為解析共生微生物與宿主之間復(fù)雜的雙向相互作用的提供了重要工具，使微生物代謝物，類器官和已知菌小鼠，研究人員可以特異性地識別體內(nèi)外微生物信號并將它們與宿主內(nèi)的變化聯(lián)系起來，可用于開發(fā)設(shè)計微生物混合物或新一代益生菌。

5. 具體實驗流程

Step1. 在ZMB1培養(yǎng)基中培養(yǎng)厭氧菌，收集細(xì)菌代謝產(chǎn)物

Step2. 準(zhǔn)備供定植的細(xì)菌或糞便

Step3. 腸類器官顯微注射

Step4. 無菌小鼠準(zhǔn)備

Step5. 腦組織分離和代謝物提取

Step6. 腸道內(nèi)容物收集和代謝物提取

Step7. 糞便樣品代謝物提取

Step8. LC-MS/MS分析制備的生物樣品

圖4. 體外培養(yǎng)基和體內(nèi)糞便樣本中SCFAs的絕對濃度

腸-腦軸研究熱點促進(jìn)了分析微生物和宿主來源定量分析平臺的發(fā)展，對體外(類器官)和體內(nèi)小鼠模型系統(tǒng)中代謝物的綜合評估策略：階段1-微生物在確定的培養(yǎng)基中生長；階段2-腸道類器官顯微注射;階段3-動物模型的生成，包括無菌(無微生物)、無特定病原體(完整腸道微生物群)和無特定病原體再常規(guī)化(無菌小鼠與來自無特定病原體小鼠的完整腸道微生物群相關(guān))，及牙雙歧桿菌和卵形擬桿菌單相關(guān)小鼠(無菌小鼠定植單一腸道微生物)。建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的代謝組學(xué)方法用于分析這些樣品中微生物衍生的短鏈脂肪酸和神經(jīng)遞質(zhì)。約4-5周即可完成該方案中細(xì)菌培養(yǎng)、類器官培養(yǎng)和體內(nèi)樣本三種實驗?zāi)Ｐ�、菌群衍生代謝物定量、數(shù)據(jù)下機(jī)和歸一化、統(tǒng)計分析等。

繪譜幫你測

SCFAs是最重要的宿主-微生物代謝相互作用的途徑，在不同組織中濃度差異較大，給檢測帶來一定的困難。麥特繪譜聯(lián)合代謝組學(xué)研究常用的LC-MS和GC-MS兩大技術(shù)平臺，配合使用衍生化、同位素內(nèi)標(biāo)等方法定量絕對濃度，精準(zhǔn)適配多種樣本類型中SCFAs的檢測。

備注：檢索各領(lǐng)域文獻(xiàn)數(shù)量占比

參考文獻(xiàn)

Horvath Thomas D,Haidacher Sigmund J,Engevik Melinda A, et al. Interrogation of the mammalian gut-brain axis using LC-MS/MS-based targeted metabolomics with in vitro bacterial and organoid cultures and in vivo gnotobiotic mouse models. Nat Protoc. 2023

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