客戶案例：具核梭桿菌通過代謝產物琥珀酸促進結直腸癌免疫治療耐藥

免疫檢查點阻斷（ICB）治療是一種有效的治療策略，但在轉移性結直腸癌（mCRC）患者中，只有少數(shù)患者對ICB治療有應答。近期有研究表明腸道微生物群可能影響腫瘤對免疫治療的應答，并且與ICB的免疫相關毒性有關。糞菌移植（FMT）已被證明可以克服黑色素瘤患者對免疫療法的耐藥性。

具核梭桿菌（F. nucleatum）是一種致病性腸道細菌，與CRC預后不良相關。它產生的毒力因子如Fap2和FadA在腫瘤中發(fā)揮作用，并促進CRC的生長。此外，具核梭桿菌產生的代謝物如琥珀酸、甲酸和丙酸在介導微生物群和宿主免疫系統(tǒng)之間的相互作用中起到關鍵作用。特別是甲酸鹽被報道可加劇CRC細胞的干性、侵襲和轉移。然而，目前還沒有闡明具核梭桿菌代謝產物與免疫治療之間的相互作用及其在結直腸癌中的潛在機制。

2023年5月，上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院消化內科房靜遠/陳縈晅團隊在Cell Host & Microbe（IF 30.3）發(fā)表了題為“Fusobacterium nucleatum-derived succinic acid induces tumor resistance to immunotherapy in colorectal cancer”的文章。本研究整合了接受免疫治療的CRC患者的代謝組學和微生物組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在接受免疫治療的CRC患者中，具核梭桿菌的存在與免疫治療無應答有關。具核梭桿菌通過產生琥珀酸降低對抗PD-1單克隆抗體的敏感性，并抑制了腫瘤微環(huán)境中CD8+T細胞的轉運，從而限制了抗腫瘤反應。這些研究揭示了具核梭桿菌代謝產物與免疫治療之間的相互作用，為克服免疫治療耐藥性提供了潛在策略。（麥特繪譜提供Q300全定量代謝組檢測服務）

高豐度的具核梭桿菌與mCRC免疫治療療效下降相關

研究人員對接受PD-1阻斷劑聯(lián)合瑞戈非尼（regorafenib）治療的9例（隊列1A）mCRC患者進行了宏基因組測序，并分析了糞便中的細菌模式，發(fā)現(xiàn)在這些患者中，應答者和無應答者之間的糞便樣本的β多樣性存在顯著差異，而α多樣性沒有顯著差異。此外，通過線性判別分析（LEfSe）分析，研究人員發(fā)現(xiàn)在無應答者的糞便中富集了梭桿菌屬（Fusobacterium）、擬桿菌屬（Alistipes）、Odoribacter、Bilophila和Indibacter等細菌。實時熒光定量PCR結果顯示，在無應答者組的糞便樣本中，具核梭桿菌是含量最高的細菌。在隊列1B中，具核梭桿菌豐度較高的患者的無進展生存期（PFS）低于具核梭桿菌豐度較低的患者。放射學圖像顯示，在隊列1A中，患者2的糞便具核梭桿菌豐度相對較低。在接受PD-1阻斷治療后，腫瘤消退并且核瘤豐度下降，而具核梭桿菌豐度較高的患者9顯示腫瘤進展。接下來，隊列2中檢測了接受PD-1阻斷劑聯(lián)合瑞戈非尼治療的mCRC患者的福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）腫瘤組織中具核梭桿菌的豐度。實時熒光定量PCR顯示，與有反應的患者相比，無反應的患者的FFPE組織中具核梭桿菌升高，而其他細菌沒有升高。且與具核梭桿菌豐度較低的患者相比，具核梭桿菌豐度較高的患者的PFS和總生存期（OS）較差。此外，研究人員利用隊列2中結直腸癌患者的糞便微生物移植（FMT），對使用抗生素混合物（ABX）進行處理的小鼠進行重新定植，結果顯示，接受低具核梭桿菌應答者糞便樣本的小鼠對PD-1抗體敏感，而接受高具核梭桿菌應答者糞便樣本的小鼠對PD-1抗體產生耐藥性。這些研究結果表明高具核梭桿菌豐度與mCRC患者免疫治療效果下降相關。

圖1. 高豐度的具核梭菌與mCRC免疫治療療效下降相關

具核梭桿菌損害抗腫瘤CD8+T細胞免疫以降低對免疫治療的反應

為探討具核梭桿菌對抗PD-1單抗體內抗腫瘤效應的影響，作者將MC38和CT26腫瘤細胞分別接種于無菌（GF）和SPF小鼠皮下。在小鼠出現(xiàn)可觸及的腫瘤時，對其進行抗PD-1單抗治療和具核梭桿菌口服給藥，研究發(fā)現(xiàn)抗PD-1抗體可以減緩腫瘤生長。但是在用兩種具核梭桿菌菌株（ATCC-25586或ATCC-23726）灌胃的小鼠中，其療效逐漸減弱。16S rRNA測序進一步表明，具核梭桿菌在免疫治療期間未影響總體腸道微生物群組成。由于具核梭桿菌菌株（ATCC-25586）是標準毒力菌株，并且在之前的研究中被廣泛使用，因此研究者選擇它進行進一步的機制研究，進一步證實了具核梭桿菌在降低GF小鼠抗PD-1單抗療效中起著直接作用。此外，具核梭桿菌降低了SPF CT26荷瘤小鼠對抗PD-1單抗的敏感性。

為了研究具核梭桿菌是否損害了抗PD-1單抗的免疫應答，作者檢測了MC38荷瘤小鼠腫瘤、脾臟和引流淋巴結（DLN）的不同免疫細胞亞群。免疫細胞圖譜顯示，在抗PD-1單抗存在的情況下，口服具核梭桿菌減少了腫瘤內CD8+T細胞的浸潤，但未減少脾臟或DLN組織內的浸潤，而腫瘤內的CD4+T細胞、自然殺傷細胞或調節(jié)性T細胞無差異。與此同時，通過免疫組織化學染色（IHC）觀察到，在使用抗PD-1單抗的具核梭桿菌腫瘤中，CD8+T細胞較少。這些數(shù)據(jù)表明，具核梭桿菌可能通過抑制CD8+T細胞的聚集和細胞毒性來降低免疫治療的療效。

圖2. 具核梭桿菌損害抗腫瘤CD8+T細胞免疫以降低對免疫治療的反應

具核梭桿菌通過其代謝物琥珀酸減弱對免疫治療的反應

作者對隊列1A的血清樣本進行了代謝組學分析，研究發(fā)現(xiàn)4種代謝物在無應答者中顯著升高（圖3A），同時，采用非靶向液相色譜-串聯(lián)質譜（LC-MS/MS）鑒定了培養(yǎng)上清液中具核梭桿菌顯著升高的代謝物（圖3B）。然后，進一步分析了日本一個隊列（Yachida隊列）中梭桿菌水平高的CRC患者的代謝組學數(shù)據(jù)。維恩圖中三個數(shù)據(jù)集的重疊表明，琥珀酸可能是具核梭桿菌的代謝物，影響CRC的免疫治療反應（圖3C）。

隨后，作者檢測了細菌培養(yǎng)上清液中的琥珀酸水平，發(fā)現(xiàn)兩種具核梭桿菌菌株產生的琥珀酸水平是大腸桿菌或BHC（腦心浸液培養(yǎng)基）培養(yǎng)的2~5倍以上。之前有報道顯示，在厭氧環(huán)境下，具核梭桿菌主要通過三羧酸循環(huán)（TCA）的還原分支途徑（草酸/蘋果酸/延胡索酸/琥珀酸）產生琥珀酸，其中最后一步由延胡索酸還原酶（frd）催化。為了進一步驗證具核梭桿菌產生琥珀酸的能力，研究人員在具核梭桿菌中敲除了frdA。與野生型具核梭桿菌相比，具核梭桿菌缺乏frdA導致琥珀酸產量減少（圖3F）。然后測定了GF小鼠的琥珀酸濃度，發(fā)現(xiàn)在經抗PD-1單抗治療的具核梭桿菌單定植小鼠中，糞便和血清琥珀酸均升高。接下來，使用兩種結直腸癌的皮下小鼠模型來檢測琥珀酸是否對體內抗PD-1單抗反應有直接影響。與PBS相比，琥珀酸口服給藥和腹腔內給藥均降低了體內免疫療法的治療效果。此外，口服或腹腔內給予琥珀酸聯(lián)合抗PD-1單抗治療顯著減少了CD8+T細胞在腫瘤中的浸潤，并損害了CD8+T細胞的細胞毒性。

為了確定琥珀酸的臨床相關性，研究者分析了Yachida隊列中的糞便琥珀酸水平，發(fā)現(xiàn)CRC患者的糞便琥珀酸水平高于健康受試者的糞便琥珀酸水平。與此一致，隊列4的CRC患者的血清琥珀酸水平也比健康受試者高。在隊列4配對的CRC患者中，觀察到血清琥珀酸水平與糞便具核梭桿菌豐度呈正相關。為了研究琥珀酸與CRC免疫治療之間的關系，收集了隊列5中接受抗PD-1單抗治療的33例mCRC患者的血清樣本，發(fā)現(xiàn)對免疫治療無應答的患者有顯著較高的琥珀酸水平，并且血清琥珀酸水平較高的患者與血清琥珀酸水平較低的患者相比，PFS較短。由于之前的文章已經報道擬桿菌門被認為是琥珀酸的主要產生者，因此研究者在MC38攜帶腫瘤的SPF小鼠中研究了糞便脆弱擬桿菌（B. fragilis）、普通類桿菌（B. vulgatus）和多形擬桿菌（Bacteroidetes thetaiotaomicron）的豐度，發(fā)現(xiàn)具核梭桿菌給藥后，脆弱擬桿菌、普通擬桿菌和多形擬桿菌的豐度無差異。綜上所述，具核梭桿菌通過其代謝產物琥珀酸減弱對免疫治療的反應。

琥珀酸受體1（SUCNR1）是一種琥珀酸受體。因此，接下來研究具核梭桿菌是否通過SUCNR1降低了對腫瘤細胞的免疫治療效果。在MC38腫瘤荷瘤小鼠中，敲低SUCNR1可阻斷具核梭桿菌誘導的免疫治療耐藥性。這些數(shù)據(jù)表明，由具核梭桿菌代謝產物琥珀酸介導的免疫治療失敗反應依賴于結直腸癌細胞上的SUCNR1受體。

圖3. 具核梭桿菌通過其代謝物琥珀酸減弱對免疫治療的反應

用甲硝唑清除腸道具核梭桿菌可使腫瘤對免疫治療重新敏感

為了確定用抗生素清除腸道具核梭桿菌是否會使腫瘤對免疫治療重新敏感，作者使用甲硝唑（梭桿菌敏感）和紅霉素（梭桿菌耐藥）對小鼠進行了治療。觀察到甲硝唑使具核梭桿菌誘導的耐藥腫瘤對抗PD-1單抗重新敏感（圖4A），并降低了糞便具核梭桿菌豐度和血清琥珀酸水平。然而，口服紅霉素并未使腫瘤對抗PD-1單抗重新敏感，并影響糞便具核梭桿菌豐度和血清琥珀酸水平。在CT26荷瘤小鼠中也觀察到類似結果。此外，在接受具核梭桿菌和抗PD-1單抗治療的小鼠中，甲硝唑足以恢復腫瘤內CD8+T細胞浸潤和細胞毒性。為了確定甲硝唑清除具核梭桿菌是否通過激活CD8+T細胞介導的抗腫瘤免疫使腫瘤對抗PD-1單抗重新敏感，研究者使用CD8-或CD4-中和抗體去除小鼠的CD8+或CD4+T細胞。發(fā)現(xiàn)在用甲硝唑根除具核梭桿菌后，清除CD8+T細胞（而不是CD4+T細胞）消除了抗PD-1單抗的療效。這些數(shù)據(jù)表明，用抗生素甲硝唑根除具核梭桿菌可通過CD8+T細胞依賴的方式使腫瘤對抗PD-1單抗重獲敏感。

圖4. 甲硝唑消除腸道核仁梭菌使腫瘤對免疫治療重新敏感

具核梭桿菌衍生的琥珀酸損害cGAS介導的IFN-β反應，從而減弱對免疫治療的反應

為了研究具核梭桿菌衍生的琥珀酸損害抗腫瘤免疫的分子機制，作者在抗PD-1和具核梭桿菌聯(lián)合抗PD-1單抗治療的GF小鼠之間的腫瘤中進行了RNA-seq分析。研究發(fā)現(xiàn)，在具核梭桿菌聯(lián)合抗PD-1單抗治療的小鼠腫瘤中，與“IFN-β產生”和“適應性免疫應答”相關的基因顯著減少（圖5A）。有文獻報道，免疫應答缺失與癌癥的免疫逃避和免疫治療抵抗有關。實時熒光定量PCR顯示，在抗PD -1單抗存在的情況下，具核梭桿菌降低了MC38和CT26荷瘤小鼠腫瘤中的IFN-β水平。為了進一步闡明具核梭桿菌代謝產物琥珀酸對IFN-β的作用，研究者在人結直腸癌細胞系（HT-29和LoVo）中進行了體外分析，發(fā)現(xiàn)經具核梭桿菌上清液或琥珀酸處理的結直腸癌細胞系中IFN-β的表達降低。具核梭桿菌衍生的琥珀酸抑制IFN-β反應以促進結直腸癌的免疫治療抵抗。

cGAS結合并激活IFN應答的刺激物cGAMP相互作用分子（STING），誘導IIFN，對免疫治療的抗腫瘤免疫至關重要。作者假設具核梭桿菌誘導的腫瘤未能通過cGAS通路對免疫治療產生應答，通過實時熒光定量PCR表明，在抗PD -1單抗存在的情況下，具核梭桿菌降低了CRC荷瘤小鼠腫瘤中的cGAS表達。在體外，實時熒光定量 PCR和Western Blot表明，具核梭桿菌上清液或琥珀酸處理后，cGAS表達下調。

Th1型趨化因子CCL5和CXCL10是兩個關鍵的IFN應答蛋白，介導效應T細胞向腫瘤的轉運。在經具核梭桿菌上清液或琥珀酸處理的CRC細胞中，CCL5和CXCL10的表達下調。此外，cGAS過表達消除了CRC細胞中琥珀酸或具核梭桿菌上清液誘導的IFN-β表達降低。遷移實驗表明，琥珀酸和具核梭桿菌上清液減少了CD8+T細胞的遷移，而rCCL5和rCXCL10在體外阻斷了CD8+T細胞的遷移。研究結果表明，具核梭桿菌衍生的琥珀酸破壞cGAS介導的IFN-β通路，減少腫瘤中Th1型趨化因子，從而抑制CD8+T細胞向腫瘤的體外遷移。

為了探討cGAS在腫瘤細胞中過表達是否能增強抗腫瘤免疫并阻斷具核梭桿菌代謝產物誘導的ICB-抑制作用。研究人員使用慢病毒在腫瘤細胞上過表達cGAS，發(fā)現(xiàn)cGAS的過表達可通過增強免疫反應、增加CD8+T細胞的浸潤和提高細胞毒性作用，逆轉具核梭桿菌代謝產物引起的腫瘤對免疫治療的抵抗效應。據(jù)報道，腫瘤細胞內源性和宿主來源的cGAS-STING通路均有助于ICB的治療。為了檢測腫瘤細胞內或宿主來源的cGAS-STING通路是否參與了甲硝唑對抗PD-1單抗的重新敏感性，作者將對照細胞（MC38-Cgas+/+）和CRISPR-Cas9 cGAS-KO細胞 （MC38-Cgas-/-） 植入了野生型小鼠中，并觀察到用甲硝唑根除具核梭桿菌使腫瘤對抗PD-1單抗重獲敏感，而這種敏感性可通過清除腫瘤固有cGAS而消除。然后，將MC38細胞植入到野生型或cGAS缺陷小鼠中，宿主cGAS的耗竭并未改變甲硝唑的效果。這些數(shù)據(jù)表明具核梭桿菌衍生的琥珀酸誘導了IFN-β應答的喪失和對免疫治療的抵抗，而甲硝唑通過依賴于腫瘤細胞衍生的cGAS通路使腫瘤對免疫治療重新敏感。

圖5. 具核梭桿菌衍生的琥珀酸損害cGAS介導的IFN-β反應，減弱對免疫治療的反應

具核梭桿菌衍生的琥珀酸激活SUCNR1-HIF-1α-EZH2軸減弱對免疫治療的反應

為了確定具核梭桿菌代謝產物琥珀酸抑制cGAS表達的機制，作者進行了熒光素酶報告基因檢測，觀察到在經琥珀酸或具核梭桿菌上清液處理的CRC細胞中，cGAS啟動子的轉錄活性受到抑制。隨后使用加州大學圣克魯茲分校（UCSC）基因組數(shù)據(jù)庫預測了87個基因作為cGAS潛在的轉錄調控元件，分析了具核梭桿菌處理的CRC細胞的RNA-seq基因圖譜，研究發(fā)現(xiàn)EZH2、MXI1, STAT3， ELF1，TBP，GTF2F1和E2F4這些基因在具核梭桿菌處理的細胞中顯著上調。此外，實時熒光定量PCR顯示，經具核梭桿菌上清液或琥珀酸處理后，EZH2表達上調。因此，EZH2可能是一個與cGAS啟動子區(qū)結合的轉錄調控元件。為了檢驗這一假設，通過實時熒光定量PCR和蛋白質印跡法證明，沉默EZH2顯著上調了cGAS的表達。染色質免疫沉淀實驗表明，EZH2直接與cGAS的啟動子區(qū)域結合，并且在琥珀酸或具核梭桿菌上清液處理的LoVo細胞中結合增強。

EZH2作為多梳抑制復合體2的主要成分，催化組蛋白H3第27位賴氨酸甲基化從而沉默其靶基因的表達。通過ChIP結果顯示，琥珀酸或具核梭桿菌上清液處理LoVo細胞后，啟動子區(qū)H3K27me3水平升高，確定了具核梭桿菌通過調控啟動子區(qū)H3K27me3水平來抑制cGAS轉錄。隨后，研究者使用兩種體內模型來研究EZH2抑制劑（GSK126）治療是否可以在體內阻斷具核梭桿菌誘導的免疫治療抵抗。結果發(fā)現(xiàn)GSK126阻斷了具核梭桿菌誘導的抗PD-1單抗耐藥。表明具核梭桿菌衍生的琥珀酸激活腫瘤細胞上的EZH2，從而導致腫瘤對免疫治療的抵抗。

據(jù)報道，在癌癥中，琥珀酸蓄積可穩(wěn)定缺氧誘導因子1α（HIF-1α）并促進腫瘤進展。活性氧（ROS）的產生促進HIF-1α與EZH2啟動子結合，導致EZH2表達升高。假設具核梭桿菌衍生的琥珀酸激活SUCNR1- HIF-1α-EZH2軸，從而抑制腫瘤對免疫治療的反應。實驗表明HIF-1α在經琥珀酸或具核梭桿菌上清液處理的CRC細胞中被激活。此外，Bay 87- 2243和2-MeOE2（HIF-1α的藥物抑制劑）處理可抑制EZH2表達和啟動子熒光素酶活性。同時，ChIP實驗驗證了HIF-1α直接結合于EZH2啟動子區(qū)域。然后，研究者探討HIF-1α抑制劑（Bay87-2243）是否可以在體內阻斷具核梭桿菌誘導的免疫治療抵抗。結果發(fā)現(xiàn)Bay 87-2243處理減弱了具核梭桿菌誘導的抗PD-1單抗耐藥性。這些結果證實了具核梭桿菌的代謝產物琥珀酸激活了SUCNR1-HIF-1α-EZH2軸，從而導致CRC對免疫治療無效。

圖6. 具核梭桿菌衍生的琥珀酸激活SUCNR1-HIF-1α-EZH2軸減弱對免疫治療的反應

具核梭桿菌、EZH2和cGAS水平與結直腸癌患者的預后相關

為了探索EZH2，cGAS，IFN-β和Th1型趨化因子在預測結CRC患者PD-1阻斷治療反應中的作用，用免疫組化檢測隊列2中EZH2-cGAS- IFN-β軸的蛋白水平，檢測發(fā)現(xiàn)，與有應答者相比，無應答者的腫瘤組織中檢測到較高水平的EZH2，較低水平的cGAS、IFN-β以及Th1型趨化因子CCL5和CXCL10。在隊列2中，具核梭桿菌的數(shù)量與cGAS、IFN-β、CCL5和CXCL10的表達水平以及CD8+T細胞密度呈負相關，與EZH2的表達呈正相關。最后，研究者評估了隊列2中EZH2-cGAS- IFN-β與患者生存的相關性，觀察到cGAS、IFN-β和Th1型趨化因子水平較高的患者PFS延長，EZH2水平較低的患者OS延長，而cGAS水平較高的患者OS較好。數(shù)據(jù)表明，F. nucleatum-EZH2-cGAS軸可能用作結直腸癌中PD-1阻斷的潛在預后標志物。

具核梭桿菌產生的琥珀酸可激活琥珀酸受體SUCNR1-HIF-1α-EZH2軸，從而損害cGAS-IFN-β通路，并減少腫瘤中的Th1型趨化因子CCL5和CXCL10，從而限制CD8+T細胞運輸?shù)絋ME，從而降低CRC中PD-1阻斷治療的抗腫瘤應答。

圖7. 具核梭桿菌、EZH2和cGAS水平與結直腸癌患者的預后相關

結論

本研究對接受免疫治療的結直腸癌患者的臨床管理具有重要意義。糞便具核梭桿菌豐度和血清琥珀酸濃度與免疫治療療效密切相關，而且糞便具核梭桿菌和血清琥珀酸可能作為預測免疫治療療效的無創(chuàng)生物標志物。此外，根除腸道具核梭桿菌或降低琥珀酸含量可能是提高CRC免疫治療臨床應答的有效策略。

機理模式圖

原文信息

Jiang SS, Xie YL, Xiao XY, et al. Fusobacterium nucleatum-derived succinic acid induces tumor resistance to immunotherapy in colorectal cancer. Cell Host & Microbe. 2023.

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