白蛋白基花菁-克唑替尼偶聯(lián)納米粒子實(shí)現(xiàn)NIR-II成像化學(xué)光療

引言：結(jié)直腸癌是目前世界上第三致命的癌癥。與傳統(tǒng)的寬光篩查內(nèi)窺鏡檢查相比，基于分子探針的近紅外-II (NIR-II)熒光成像能夠有效識(shí)別病變靶點(diǎn)，提高圖像對(duì)比度，提高早期腫瘤檢出率。c-Met在CRC晚期過(guò)度表達(dá)，是一種腫瘤生物標(biāo)志物。在此，基于克唑替尼（Crizotinib）對(duì)c-Met陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的良好靶向抑制作用，染料IR808與藥物分子Crizotinib共價(jià)結(jié)合，從而合成了靶向c-Met陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的近紅外熒光探針Crizotinib-IR808。然后，水不溶性Crizotinib-IR808與具有生物相容性和生物安全性良好的牛血清白蛋白納米粒子(BSA NPs)制備了 Crizotinib-IR808@BSA NPs。Crizotinib-IR808@BSA NPs具有腫瘤靶向能力，可用于無(wú)創(chuàng)生物醫(yī)學(xué)血管NIR-II成像和術(shù)中實(shí)時(shí)NIR-II成像，以指導(dǎo)腫瘤切除。在808 nm激光照射下，Crizotinib-IR808 @ BSA NPs對(duì)腫瘤表現(xiàn)出協(xié)同光療效應(yīng)�？傊�，這種創(chuàng)新的影像介導(dǎo)的多功能聯(lián)合治療策略具有良好的c-Met靶向能力，可能成為一種新的治療結(jié)直腸癌的方法。

 

 

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研究?jī)?nèi)容：作者設(shè)計(jì)并合成一種Crizotinib-IR808偶合物，以研究其在結(jié)直腸癌中的NIR-II成像引導(dǎo)的協(xié)同化學(xué)光療。選擇Crizotinib的哌啶胺作為IR808的連接子，因?yàn)樵搮^(qū)域暴露于與Crizotinib共結(jié)晶的c-Met晶體結(jié)構(gòu)中的溶劑區(qū)域。根據(jù)預(yù)測(cè)，該區(qū)域的化學(xué)變化對(duì)Crizotinib與c-Met 的ATP結(jié)合口袋中的關(guān)鍵殘基的相互作用幾乎沒(méi)有影響，從而保持了藥物-染料偶聯(lián)物的效力。然后，使用具有高穩(wěn)定性、非抗原性和生物安全性的牛血清白蛋白納米粒子制備Crizotinib-IR808 @ BSA NPs。將制備的Crizotinib-IR808 @ BSA NPs用于腫瘤NIR-II成像以及術(shù)中NIR-II成像引導(dǎo)的腫瘤切除。此外，還研究了Crizotinib-IR808 @ BSA NPs用于化療協(xié)同PDT和PTT的腫瘤消除。

圖1. Crizotinib-IR808@BSA的特性 (A) TEM圖像 (B)流體動(dòng)力學(xué)粒徑和(C)ζ電勢(shì)。(D) Crizotinib -IR808和Crizotinib -IR808@BSA的吸收光譜和(E)近紅外熒光發(fā)射光譜(6μm)。(F)在不同溶劑中的NIR-II熒光圖像。(G) Crizotinib-IR808與BSA的分子對(duì)接(PDB ID: 6QS9)。(H)Crizotinib-IR808在含有白蛋白結(jié)合位點(diǎn)I、II、III和α1-羥基脂肪蛋白抑制劑的BSA水溶液中的歸一化發(fā)射強(qiáng)度。

 

TEM圖像顯示，Crizotinib-IR808 @ BSA NPs呈球形，在水溶液中均勻分布，直徑為128.8 ± 9.4 nm。DLS實(shí)驗(yàn)表明，平均水合直徑為156.3 nm，與TEM的結(jié)果相符。與BSA相比，Crizotinib-IR808@BSA NPs的ζ電勢(shì)向正方向移動(dòng)了-5.2mV。紫外-可見(jiàn)吸收光譜顯示，水中的Crizotinib-IR808 @ BSA NPs在778 nm處出現(xiàn)明顯的吸收峰，與DMSO中的Crizotinib-IR808相似，比水中的游離Crizotinib-IR808懸浮液的吸收峰更尖銳。通過(guò)光穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)得出Crizotinib-IR808@BSA NPs的光穩(wěn)定性強(qiáng)于Crizotinib-IR808，證明BSA NPs是防止Crizotinib-IR808在水中聚集或水解的有效方法。使用先前報(bào)道的方法，作者更詳細(xì)地評(píng)估了Crizotinib-IR808的BSA結(jié)合位點(diǎn)。白蛋白結(jié)合位點(diǎn)I、II、III和1-羥基糖脂蛋白的抑制劑分別是華法林、布洛芬、地高辛和奎尼啶，發(fā)現(xiàn)華法林能夠顯著降低熒光，表明對(duì)白蛋白Sudlow位點(diǎn)I具有高親和力。

圖2. 體外光熱效應(yīng)和ROS生成 (A)不同梯度濃度和(B)不同輻照強(qiáng)度下的實(shí)時(shí)紅外熱像圖和溫度變化曲線。(C)光熱轉(zhuǎn)換效率 (D)光熱穩(wěn)定性。(E)用Crizotinib-IR808@BSA進(jìn)行DPBF預(yù)培養(yǎng)的吸收光譜。(F)在DMSO中用不同輻射強(qiáng)度的Crizotinib-IR808@BSA進(jìn)行DPBF預(yù)培養(yǎng)的相對(duì)吸光度。

 

首選研究了Crizotinib-IR808@BSA NPs的光轉(zhuǎn)化能力，得出其溫度升高與濃度和激光強(qiáng)度有關(guān)。與臨床常用的光敏劑ICG相比，Crizotinib-IR808@BSA NPs有更好的PCE。為了研究光穩(wěn)定性，通過(guò)五次激光ON/OFF加熱循環(huán)，Crizotinib-IR808@BSA NPs光熱性能幾乎不變。然后研究了 Crizotinib-IR808 和 1O2 探針 DPBF 混合物的紫外可見(jiàn)光譜，以確定產(chǎn)生 ROS 的能力。發(fā)現(xiàn)在 Crizotinib-IR808@BSA NPs 的存在下，DPBF 在 415nm波長(zhǎng)處的吸收強(qiáng)度隨時(shí)間和激光功率的變化而下降。鑒于這些發(fā)現(xiàn)，Crizotinib-IR808 @BSA NPs可能成為808 nm單波長(zhǎng)激光協(xié)同PDT/PTT治療的候選藥物。

圖3. 體外協(xié)同抗腫瘤作用 (A) CT26 細(xì)胞中Crizotinib-IR808@BSA 與 Mito-Tracker Green的共聚焦顯微圖像。(B) 使用或不使用激光照射的情況下，用Crizotinib-IR808@BSA處理CT26細(xì)胞24 h的存活率。CT26細(xì)胞在不同處理組中的(C) DCFH-DA染色熒光圖像、(D)Calcein AM/PI 染色熒光圖像和(E)膜聯(lián)蛋白V-FITC/PI分析。

 

接著，分析了在細(xì)胞水平的性能。首先，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)和CLSM研究CT26細(xì)胞對(duì)Crizotinib-IR808@BSA NPs的攝取。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞攝取出現(xiàn)在前30 min內(nèi)，2 h后趨于穩(wěn)定。Crizotinib-IR808@BSA NPs 的紅色信號(hào)與Mito-track探針的綠色信號(hào)呈現(xiàn)出共定位，表明它能夠在線粒體積累。DCFH-DA是ROS檢測(cè)器，在IR808和Crizotinib-IR808 @ BSA NPs+激光組中觀察到綠色熒光，表明它們可被激光激活誘導(dǎo)ROS生成。使用Calcein AM/PI進(jìn)行染色實(shí)驗(yàn)，以識(shí)別活體（綠色）和死亡（紅色）的 CT26 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)激光照射產(chǎn)生的光療與化療協(xié)同作用，增加了Crizotinib- IR808@BSA NPs對(duì)癌細(xì)胞的毒性。

圖4. 體內(nèi)NIR-II熒光成像性能 (A)注射Crizotinib -IR808@BSA后不同時(shí)間點(diǎn)荷瘤小鼠的NIR-II熒光圖像和(B)腫瘤的熒光強(qiáng)度。(C)Crizotinib-IR808@ BSA注射后24小時(shí)NIR-II成像下手術(shù)過(guò)程圖像。(D)注射Crizotinib -IR808@BSA后主要器官及腫瘤熒光強(qiáng)度的離體熒光圖像和(E)半定量分析。

 

為了探究體內(nèi)腫瘤成像能力，將Crizotinib-IR808 @ BSA NPs注射到CT26荷瘤小鼠中，發(fā)現(xiàn)熒光亮度在24 h達(dá)到最大值，72 h后減弱。之后，在NIR-II成像指導(dǎo)下對(duì)CT26荷瘤小鼠進(jìn)行了腫瘤切除，證明Crizotinib-IR808 @ BSA NPs能夠正確指導(dǎo)腫瘤的完全切除。對(duì)切除的腫瘤和主要器官進(jìn)行了離體NIR-II成像分析，發(fā)現(xiàn)Crizotinib-IR808 @ BSA NPs對(duì)腫瘤具有高選擇性，此外還在肝臟和腎臟中聚集，并且兩者的信號(hào)強(qiáng)度都隨著時(shí)間降低，表明可能存在的排泄途徑。

 

為了探究體內(nèi)光療抗腫瘤活性，通過(guò)紅外溫度計(jì)跟蹤荷瘤小鼠的溫度波動(dòng)，發(fā)現(xiàn)Crizotinib-IR808 @ BSA NPs在體內(nèi)能維持接近50℃的最高溫度殺死腫瘤細(xì)胞，同時(shí)減輕在過(guò)高溫度(> 60°C)對(duì)正常組織的傷害。進(jìn)一步研究其協(xié)同光熱治療的抗癌效果，在接受激光照射后，給予Crizotinib-IR808@BSA NPs的小鼠中的腫瘤顯著縮小且大部分消失，腫瘤的相對(duì)體積和重量均有顯著降低。各組之間的體重輕微增加且無(wú)顯著差異，這表明治療通常耐受良好。染色實(shí)驗(yàn)顯示與對(duì)照組(單獨(dú)使用PBS、PBS +激光和Crizotinib-IR808@BSA NPs)相比，Crizotinib-IR808@BSA NPs +激光治療組的腫瘤細(xì)胞壞死/凋亡面積更大。以上結(jié)果與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，表明激光照射Crizotinib-IR808 @ BSA NPs可與化療、PDT和PTT同時(shí)進(jìn)行，以抑制腫瘤。

圖6. 體內(nèi)毒理學(xué)分析 (A)CT26荷瘤小鼠不同治療后血液生物標(biāo)志物的血液生化測(cè)定。(B)不同治療組的主要器官代表性H&E染色圖像。

 

為了探究Crizotinib-IR808@BSA NPs的毒性和藥代動(dòng)力學(xué)，對(duì)小鼠血液中的Crizotinib-IR808濃度進(jìn)行實(shí)時(shí)半定量，得到其半衰期為24.23 min。血試驗(yàn)測(cè)量了紅細(xì)胞(RBC)的溶血率，測(cè)定結(jié)果溶血率低于1%，表明Crizotinib-IR808 @ BSA NPs具有優(yōu)異的血液相容性。通過(guò)血液生化分析進(jìn)一步證實(shí)了使用Crizotinib-IR808 @ BSA NPs治療對(duì)肝、腎或心臟功能參數(shù)無(wú)影響。此外，注射Crizotinib-IR808 @ BSA NPs的健康小鼠的主要器官的H&E染色照片也顯示，未對(duì)小鼠產(chǎn)生顯著毒性。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，Crizotinib-IR808 @ BSA NPs具有較高的腫瘤靶向化療光療作用和較低的副作用發(fā)生率。

 

總結(jié)與展望：作者設(shè)計(jì)的Crizotinib-IR808 @ BSA NPs已成功用于體內(nèi)NIR-II成像引導(dǎo)的化學(xué)光療。Crizotinib-IR808是由臨床應(yīng)用藥物Crizotinib和近紅外熒光染料IR808共價(jià)結(jié)合而成。Crizotinib-IR808的獨(dú)特結(jié)構(gòu)賦予其c-Met靶向能力、優(yōu)異的1O2生成效率和高光熱轉(zhuǎn)換效率，具有良好的體內(nèi)治療應(yīng)用前景。通過(guò)BSA封裝，Crizotinib-IR808的光學(xué)穩(wěn)定性和水溶性得到改善，并且還顯著改善了結(jié)直腸癌中的特異性積聚，從而更容易區(qū)分脈管系統(tǒng)、腫瘤和周圍邊界。除了提高小鼠壽命和完全消除腫瘤外，這種治療方法在作者的研究中也顯示出相對(duì)最小的不良作用。該生物相容性分子蛋白復(fù)合物治療探針具有高時(shí)空分辨率NIR-II成像模式和高效治療功能，有望用于腫瘤的精確檢測(cè)和高效治療。

 

參考文獻(xiàn)

Hu, Z.; Li, R.; Cui, X.; Chen, Z., Albumin-Based Cyanine Crizotinib Conjugate Nanoparticles for NIR-II Imaging-Guided Synergistic Chemophototherapy. ACS Applied Materials & Interfaces 2023, 15 (28), 33890-33902.

 

 

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