二甲雙胍在胰腺導(dǎo)管腺癌3D共培養(yǎng)模型中的抗癌作用

胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）很難在前期發(fā)現(xiàn)，因為它在無癥狀階段進展迅速，能早期轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處器官。導(dǎo)致PDAC預(yù)后不良的主要特征之一是結(jié)締組織增生，其形式為廣泛致密的纖維基質(zhì)和過量的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）。在ECM中，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）由胰腺星狀細(xì)胞（PSCs）和癌細(xì)胞分泌。在MMPs的幾種亞型中，MMP2主要與促進細(xì)胞生長和侵襲有關(guān)。

最近的研究表明，二甲雙胍是一種具有出色安全性的一線抗糖尿病藥物，可以在減少癌癥干細(xì)胞（CSCs）的數(shù)量和各種癌細(xì)胞的遷移能力方面發(fā)揮作用。例如，在胰腺癌，乳腺癌、卵巢癌和黑色素瘤中，二甲雙胍已被證明可以在體外和體內(nèi)抑制腫瘤狀態(tài)。鑒于其安全性和低成本，二甲雙胍輔助治療可能是改善PDAC預(yù)后的一個有吸引力的選擇。然而，對其益處機制的研究主要局限于細(xì)胞系，這些細(xì)胞系無法重現(xiàn)胰腺腫瘤微環(huán)境。

在胰腺中，PSCs是促進腫瘤微環(huán)境中結(jié)締組織增生反應(yīng)的中樞細(xì)胞。既往研究報道，調(diào)控PSCs可改善PDAC的治療效果。因此，有理由將具有豐富基質(zhì)的PSCs作為PDAC的重要治療靶點，這些基質(zhì)有助于化學(xué)耐藥性和高侵襲性。

最近，在韓國成均館大學(xué)醫(yī)學(xué)院三星醫(yī)學(xué)中心內(nèi)分泌與代謝系、肝膽胰腺外科系以及大邱慶北醫(yī)療創(chuàng)新基金會的一項聯(lián)合研究中，著手確定了二甲雙胍在臨床相關(guān)濃度下的抗癌作用是否可以在由患者來源的PDAC類器官和從術(shù)后組織獲得的原代人PSCs制成的PDAC三維（3D）共培養(yǎng)模型中得到證明。利用該模型，實驗探索了二甲雙胍對PSCs的抗遷移作用的關(guān)鍵機制是否是由MMP2下調(diào)，以及口服二甲雙胍（30 mg/kg）是否可以抑制免疫抑制小鼠PDAC類器官異種移植的生長。相關(guān)內(nèi)容發(fā)表在 The American Journal of Cancer Research 期刊題為“Anti-cancer effects of metformin in a 3D co-culture model of pancreatic ductal adenocarcinoma”。

首先，為了在體外探索人PDAC的表型，從人PDAC組織中分離出PSCs和PDAC類器官。

為了檢測二甲雙胍是否會影響與人 PSCs 中遷移和侵襲相關(guān)基因的 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平，在接種細(xì)胞一天后向 PSC 生長培養(yǎng)基中加入濃度為 1 μM、10 μM 和 100 μM 的二甲雙胍并處理 48 小時。結(jié)果表明，二甲雙胍處理的 PSCs 表現(xiàn)出波形蛋白、MMP2 和金屬蛋白酶2組織抑制劑（TIMP2）的表達(dá)水平降低，這是遷移和侵襲的關(guān)鍵因子。二甲雙胍劑量依賴性地降低了CD10、CD24和CD44的轉(zhuǎn)錄水平，這是各種腫瘤的基質(zhì)預(yù)后標(biāo)志物�；�于定量PCR分析，檢查了濃度為10 μM二甲雙胍的PSCs的形態(tài)變化和細(xì)胞活力，發(fā)現(xiàn)對照組和二甲雙胍處理組之間在48小時內(nèi)沒有顯著差異。

為了研究二甲雙胍是否可以抑制人PSCs的遷移能力，進行了細(xì)胞遷移測定。與對照和1 μM二甲雙胍相比，10 μM二甲雙胍顯著抑制細(xì)胞遷移形成的圓形無細(xì)胞區(qū)的封閉（圖1 A、B）。這些結(jié)果在不同N期PDAC患者的PSCs中是可重復(fù)的（圖1 C、D）。此外，研究了MMP2的蛋白質(zhì)表達(dá)和酶活性。在不同N期PDAC患者的PSCs中，MMP2蛋白水平和酶活性在對照組和二甲雙胍組之間存在顯著差異（圖1 E、G）。二甲雙胍對CD10的蛋白質(zhì)表達(dá)具有抑制作用，CD10是一種促進癌細(xì)胞進展的基質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物（圖1 F）。這些數(shù)據(jù)表明，二甲雙胍可以抑制人類PSCs的遷移能力和MMP2和CD10的表達(dá)水平。
 

圖1   二甲雙胍抑制 PSCs 的遷移能力及其對 MMP2 和 CD10 的表達(dá)。

接下來，探討了轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）信號通路（腫瘤遷移中的主要信號通路之一）在二甲雙胍降低PSCs中MMP2表達(dá)的能力中所起的作用。為了確認(rèn)PSCs，PDAC類器官以及共培養(yǎng)的PSCs和PDAC類器官分泌TGF-β，將其培養(yǎng)48 h并檢測TGF-β的分泌。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍處理組分泌的TGF-β少于對照組。然后，為了確定二甲雙胍是否影響TGF-β信號分子，在二甲雙胍存在下向PSCs施用重組TGF-β，發(fā)現(xiàn)二甲雙胍降低了MMP2、磷酸化Smad 2/3和α-SMA的表達(dá)，它們與轉(zhuǎn)移中的TGF-β信號傳導(dǎo)有關(guān)。在二甲雙胍處理的 PSCs 中，給予重組 TGF-β 逆轉(zhuǎn)了 p-Smad2/3、α-SMA 和 MMP2 的衰減。此外進行了遷移測定，以確定二甲雙胍的抗遷移作用是否獨立于AMPK途徑，結(jié)果表明，二甲雙胍的抗遷移作用與AMPK依賴性途徑無關(guān)，二甲雙胍是通過TGF-β而非AMPK信號通路減弱PSCs的遷移能力

為了研究二甲雙胍如何影響人PDAC類器官，從術(shù)后組織中分離和培養(yǎng)了類器官，并觀察48小時（圖2 A），用EhtD-1和鈣黃綠素AM染色以評估細(xì)胞活力，發(fā)現(xiàn)對照組和二甲雙胍組沒有顯著差異（圖2 B）。細(xì)胞毒性和細(xì)胞增殖測定也未顯示差異（圖2 C）。然后研究了二甲雙胍是否會降低參與癌癥侵襲性相關(guān)的癌癥干細(xì)胞（CSC）標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)癌癥干性標(biāo)志物L(fēng)GR5、CD24、CD44、CD133和EpCAM的mRNA轉(zhuǎn)錄本在N0期PDAC類器官中顯著降低（圖2 D）。在 N1 和 N2 期 PDAC 類器官中，LGR5 顯著降低（圖2 E、F）。在N0-N2期 PDAC 類器官中，CD24、CD44和EpCAM降低（圖2 D-F）。此外，二甲雙胍處理顯著降低了CSC標(biāo)志物的蛋白表達(dá)水平（圖2 G）。這些結(jié)果表明，二甲雙胍誘導(dǎo)PDAC類器官中癌癥干性標(biāo)志物的下調(diào)，而不影響細(xì)胞活力或增殖。

圖2   二甲雙胍抑制PDAC類器官腫瘤干性標(biāo)志物的表達(dá)。

進一步地，為了概括人PDAC基質(zhì)的腫瘤微環(huán)境，利用PDAC類器官和PSCs建立了體外3D直接共培養(yǎng)模型（圖3 A），PSCs包圍了PDAC類器官，而沒有干擾PDAC類器官的導(dǎo)管結(jié)構(gòu)（圖3 B）。然后比較了有和沒有二甲雙胍處理的癌癥干性因子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。二甲雙胍在3D直接共培養(yǎng)模型中減弱了CD24、CD44、CD133和LGR5的基因和蛋白表達(dá)水平（圖3 C、D），這些發(fā)現(xiàn)在N1期和N2期PDAC類器官和PSCs中是一致的，表明PDAC類器官和PSCs的共同培養(yǎng)可以模擬人PDAC基質(zhì)而不破壞導(dǎo)管結(jié)構(gòu)，而且二甲雙胍可以作為輔助治療以減少癌癥干性因子。

圖3   在基質(zhì)膠中PDAC類器官和PSCs的體外3D直接共培養(yǎng)。

此外，使用間接共培養(yǎng)系統(tǒng)檢查了二甲雙胍對PDAC 類器官和 PSCs 中癌癥侵襲和遷移標(biāo)志物基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明，二甲雙胍降低了上室PSCs中MMP2和TIMP2的基因表達(dá)，以及下室PDAC類器官中癌癥干性標(biāo)志物CD24、CD44、CD133和LGR5 的表達(dá)。

然后，研究了MMP2在二甲雙胍對PSCs的抗遷移作用中的影響，使用間接共培養(yǎng)系統(tǒng)評估了向底部孔遷移的PSCs數(shù)量（圖4 A）。為了探究MMP2下調(diào)在二甲雙胍抗遷移作用中的影響，分別用MMP2 siRNA或?qū)φ誷iRNA轉(zhuǎn)染PSCs，并使用間接3D共培養(yǎng)系統(tǒng)進行遷移測定。結(jié)果證實，用MMP2 siRNA轉(zhuǎn)染可顯著降低PSCs中MMP2的mRNA表達(dá)（圖4 B）。然后研究MMP2沉默的PSCs的遷移能力，發(fā)現(xiàn)MMP2沉默組向孔底遷移的PSCs數(shù)量明顯少于對照組（圖4 C、D）。在對照和MMP2沉默組中，二甲雙胍處理顯示出與單獨使用MMP2沉默組相同的結(jié)果（圖4 C、D）。此外，為了探索MMP2是否可以促進PSCs的遷移和侵襲能力，在培養(yǎng)基中添加了rhMMP2。與對照組相比，rhMMP2處理導(dǎo)致更增強的遷移能力。在rhMMP2組中，二甲雙胍處理與對照組一樣減弱了增強的遷移（圖4 C、D）。這些結(jié)果表明，二甲雙胍通過靶向MMP2對PSCs發(fā)揮抗遷移作用。

圖4   體外3D遷移模型中MMP2敲低對PSC遷移能力的影響。

最后，研究了臨床相應(yīng)劑量的抗高血糖藥物二甲雙胍是否會影響裸鼠皮下植入PDAC類器官的腫瘤生長，對異種移植小鼠以每天30 mg/kg口服二甲雙胍，持續(xù)28天，對照組注射無菌水。結(jié)果表明，二甲雙胍的給藥明顯減小了腫瘤體積。此外，二甲雙胍組的平均腫瘤重量明顯低于對照組，而且二甲雙胍組異種移植腫瘤的大小在視覺上小于對照組。二甲雙胍給藥28天后，癌癥干性和增殖標(biāo)志物，如CD24、CD44、CD133和Ki67的mRNA水平顯著降低。這些數(shù)據(jù)表明，二甲雙胍抑制PDAC腫瘤異種移植物在體內(nèi)的生長。

總之，二甲雙胍的抗癌作用可在使用患者來源的PDAC類器官和人原代PSCs制成的PDAC的3D直接和間接共培養(yǎng)模型中得到證實。此外，在異種移植模型中觀察到二甲雙胍的抗癌作用。該研究結(jié)果表明，二甲雙胍對PSCs的抗遷移作用的關(guān)鍵機制是通過MMP2下調(diào)發(fā)生的，這與TGF-β信號的下調(diào)有關(guān)；二甲雙胍處理還可以減弱單獨培養(yǎng)或與 PSCs 共培養(yǎng)的 PDAC 類器官的癌癥干性。這種抗癌作用是可以通過使用與2型糖尿病患者相當(dāng)劑量的臨床相關(guān)的二甲雙胍濃度來實現(xiàn)的。

參考文獻(xiàn)：Hahn S, Oh BJ, Kim H, Han IW, Shin SH, Kim G, Jin SM, Kim JH. Anti-cancer effects of metformin in a 3D co-culture model of pancreatic ductal adenocarcinoma. Am J Cancer Res. 2023 May 15;13(5):1806-1825. PMID: 37293149; PMCID: PMC10244103.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37293149/

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