文獻(xiàn)解析：血清代謝組學(xué)可高特異性區(qū)分良惡性肺結(jié)節(jié)

通過(guò)計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）鑒別診斷肺部結(jié)節(jié)在臨床實(shí)踐中具有挑戰(zhàn)性，現(xiàn)今仍有必要開發(fā)可靠、方便的生物標(biāo)志物，早期正確識(shí)別肺癌，并在最初發(fā)現(xiàn)時(shí)區(qū)分大多數(shù)良性結(jié)節(jié)，以便對(duì)惡性腫瘤展開后續(xù)治療。

2023年4月24日，中山大學(xué)胡寓旻、劉萬(wàn)里和欒天罡團(tuán)隊(duì)在國(guó)際知名期刊Nature Communications上正式發(fā)表了題為“Metabolomic differentiation of benign vs malignant pulmonary nodules with high specificity via high-resolution mass spectrometry analysis of patient sera”的研究性文章，該研究表征了480份血清樣本的代謝組，包括健康對(duì)照，良性肺結(jié)節(jié)和I期肺腺癌。腺癌組具有明顯的代謝組學(xué)特征，而良性結(jié)節(jié)和健康對(duì)照組在代謝組學(xué)譜上表現(xiàn)出相似性。該研究證實(shí)了血清代謝物生物標(biāo)志物在CT篩查肺結(jié)節(jié)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中的價(jià)值。

血清代謝組學(xué)分析

本研究采用非靶向代謝組學(xué)，通過(guò)高分辨液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（UPLC-MS/MS）對(duì)174個(gè)健康對(duì)照組（HC）、170個(gè)良性肺結(jié)節(jié)組（BN）和136個(gè)I期肺腺癌組（LA）的血清樣本進(jìn)行分析。偏最小二乘判別分析（PLS-DA）圖中，LA與BN組、LA與HC組之間有明顯的代謝組學(xué)特征分離趨勢(shì)。而在BN與HC組之間分組不明顯。LA與HC組之間有382個(gè)差異代謝物，LA與BN組之間有231個(gè)，BN與HC之間有95個(gè)（Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，F(xiàn)DR < 0.05且FC值> 1.2或< 0.83），根據(jù)m/z值、保留時(shí)間和質(zhì)譜碎片的進(jìn)一步篩選，最終在LA和BN組和LA 和HC組之間，確定了33個(gè)和38個(gè)顯著差異代謝物�？紤]到在肺腺癌亞型中表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）的基因突變較常見，本研究分析了肺腺癌組中72例具有可用EGFR狀態(tài)信息的病例樣本的整體代謝組學(xué)特征，發(fā)現(xiàn)有7個(gè)代謝物在EGFR突變型患者與EGFR野生型患者之間的代謝豐度顯著改變（VIP＞1，p < 0.05，F(xiàn)C > 1.2或 < 0.83）。7個(gè)代謝物中有5個(gè)是�；�肉堿，在脂肪酸氧化途徑中起重要作用。

圖1. 與健康對(duì)照和良性結(jié)節(jié)相比，肺腺癌的血清代謝組存在顯著差異

開發(fā)、優(yōu)化和驗(yàn)證差異血清代謝物的分類模型

在LA（n = 136）與BN（n = 170）組之間鑒定到的33個(gè)差異代謝物的基礎(chǔ)上，通過(guò)二元邏輯回歸建立代謝物生物指標(biāo)模型，采用十折交叉驗(yàn)證（10-fold cross validation）來(lái)測(cè)試模型的穩(wěn)健性。在內(nèi)部驗(yàn)證（n = 104）和外部驗(yàn)證（n = 111）隊(duì)列中分別進(jìn)行代謝組學(xué)分析，以驗(yàn)證分類模型的分類性能。在發(fā)現(xiàn)隊(duì)列(n = 306)中鑒定了27種代謝物，進(jìn)行ROC分析得到AUC（Area Under Curve）為0.933（AUC值越接近1，表示分類器性能越好），以及0.868的敏感性和0.859的特異性。

該分類模型在內(nèi)部驗(yàn)證隊(duì)列和外部驗(yàn)證隊(duì)列中得到了進(jìn)一步的驗(yàn)證。在內(nèi)部驗(yàn)證隊(duì)列中，AUC為0.915（敏感性0.867，特異性0.811），而在外部驗(yàn)證隊(duì)列中，AUC為0.945（敏感性0.810，特異性0.979）。將外部隊(duì)列中的40個(gè)樣本在外部實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了分析，分類準(zhǔn)確性AUC為0.925。由于鱗狀細(xì)胞肺癌（LUSC）是非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中僅次于腺癌的第二常見亞型，該研究還測(cè)試了經(jīng)驗(yàn)證的代謝標(biāo)志物在由74例BN和16例LUSC組成的隊(duì)列中的潛在適用性。對(duì)于LUSC vs BN的區(qū)分，AUC為0.776，相比于LUAD vs BN的區(qū)分能力較弱，表明該方法不適用于LUSC篩查。

圖2. 用于區(qū)分良惡性肺結(jié)節(jié)的血清代謝分類模型的開發(fā)和驗(yàn)證

血清代謝分類模型對(duì)同尺寸結(jié)節(jié)的診斷能力

在CT圖像上，結(jié)節(jié)大小與惡性概率呈正相關(guān)，并仍是結(jié)節(jié)管理的主要決定因素。直徑大于6mm且沒(méi)有明顯良性特征的結(jié)節(jié)被稱為不確定性肺結(jié)節(jié)（IPN），在臨床實(shí)踐中仍然是評(píng)估和管理的主要挑戰(zhàn)。通過(guò)合并來(lái)自發(fā)現(xiàn)組和內(nèi)部驗(yàn)證組的樣本，進(jìn)一步研究了結(jié)節(jié)大小對(duì)代謝組學(xué)特征的影響。首先比較了直徑小于6mm的健康對(duì)照組和良性結(jié)節(jié)的代謝組學(xué)主成分分析（PCA），發(fā)現(xiàn)大部分?jǐn)?shù)據(jù)點(diǎn)重疊在健康對(duì)照組和良性結(jié)節(jié)之間，顯示兩組血清代謝物含量的相似性，而在直徑為6-20mm的惡性結(jié)節(jié)之間觀察到了兩組間分離，該隊(duì)列在預(yù)測(cè)直徑6-20mm的結(jié)節(jié)的惡性率時(shí)，達(dá)到了0.927的AUC，0.868的特異性和0.820的靈敏性。結(jié)果表明，這一分類器可能能夠捕捉早期惡性轉(zhuǎn)化引起的代謝變化，無(wú)論結(jié)節(jié)大小如何。

圖3. 血清代謝分類器對(duì)相同大小范圍內(nèi)結(jié)節(jié)的預(yù)測(cè)效果

色氨酸代謝變化與肺腺癌的主動(dòng)糖酵解有關(guān)

通過(guò)MetaboAnalyst進(jìn)行的KEGG通路富集分析顯示，在兩個(gè)給定組（LA對(duì)比HC和LA對(duì)比BN）之間存在6個(gè)常見的顯著改變的通路，包括丙酮酸代謝、色氨酸代謝、煙酸和煙酰胺代謝、糖酵解、TCA循環(huán)和嘌呤代謝。通過(guò)三重四極桿質(zhì)譜儀(QQQ)進(jìn)行靶向代謝組學(xué)研究，絕對(duì)定量驗(yàn)證主要的代謝變化，確認(rèn)了LA組相對(duì)于BN組和HC組中升高的次黃嘌呤、黃嘌呤、丙酮和乳酸水平；同時(shí)，BN組和HC組之間這些代謝物沒(méi)有顯著差異。

考慮到LA組色氨酸代謝的顯著影響，評(píng)估了所有組中的血清色氨酸水平，發(fā)現(xiàn)LA組的血清色氨酸含量較HC組和BN組顯著降低（p < 0.001），這與之前的研究結(jié)果相符，即與健康對(duì)照組相比，肺癌患者的循環(huán)色氨酸水平較低。另一項(xiàng)使用11C-甲基-L-色氨酸作為PET/CT示蹤劑的研究表明，與良性病變或正常組織相比，肺癌組織中色氨酸信號(hào)的滯留明顯延長(zhǎng)。由此推測(cè)，LA組血清色氨酸的降低可能反映了色氨酸被活躍地?cái)z取到肺癌細(xì)胞中。

已知色氨酸代謝的最終產(chǎn)物是NAD+，它是糖酵解中丙酮酸-3-磷酸和1,3-二磷酸甘油酸反應(yīng)的必需底物。SLC7A5是色氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（QPRT）是在色氨酸代謝途徑下游將喹啉酸轉(zhuǎn)化為NAMN的酶。對(duì)LUAD的TCGA數(shù)據(jù)集的調(diào)查顯示，與正常組織相比，腫瘤組織中SLC7A5和QPRT均顯著上調(diào)。在I&II期和III&IV期的肺腺癌中均觀察到這種升高，表明與腫瘤發(fā)生相關(guān)的色氨酸代謝異常出現(xiàn)在早期。

此外，LUAD-TCGA數(shù)據(jù)集顯示癌癥患者樣本中SLC7A5和GAPDH mRNA表達(dá)呈正相關(guān)。相反，在正常肺組織中這兩種基因標(biāo)記之間沒(méi)有顯著相關(guān)性。在A549細(xì)胞中敲除SLC7A5后，色氨酸和NAD(H)的細(xì)胞水平顯著降低，導(dǎo)致胞外酸化率（ECAR）的下降，表明糖酵解活性的減弱。因此，基于血清代謝變化和體外實(shí)驗(yàn)，表明色氨酸代謝可能通過(guò)kynurenine犬尿氨酸途徑產(chǎn)生NAD+在促進(jìn)肺癌的糖酵解過(guò)程中起重要作用。

圖4. 肺腺癌色氨酸代謝與糖酵解活性的相關(guān)性

小結(jié)和展望

肺腺癌（LUAD）和鱗狀細(xì)胞癌（LUSC）是非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的兩種主要亞型。由于LUSC與吸煙有很高的關(guān)聯(lián)性，而LUAD是CT篩查中檢測(cè)到的偶然發(fā)現(xiàn)的肺結(jié)節(jié)中最常見的組織學(xué)類型，因此分類器模型是專門建立在I期腺癌樣本上的，因而在預(yù)測(cè)LUSC時(shí)準(zhǔn)確性較低（AUC 0.776），這表明LUAD和LUSC可能存在各自的代謝組學(xué)特征。已有研究表明LUAD和LUSC在病因、生物學(xué)起源和基因異常方面存在差異。因此，在篩查項(xiàng)目的一般人群中，應(yīng)該將其他類型的組織學(xué)類型納入分類模型，以便檢測(cè)肺癌。

該研究觀察到肺腺癌患者血清中丙酮和色氨酸代謝之間存在負(fù)向相關(guān)。與HC組或BN組相比，LA組的血清色氨酸水平降低。推測(cè)肺腺癌患者血清色氨酸的耗竭可能反映了對(duì)該代謝物的快速消耗。已知通過(guò)色氨酸的犬尿酸途徑進(jìn)行的色氨酸代謝的最終產(chǎn)物是新生NAD+的來(lái)源。由于大部分NAD+是通過(guò)回收途徑產(chǎn)生的，色氨酸代謝中NAD+的相關(guān)性在健康和疾病中仍需進(jìn)一步研究。對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的分析顯示，色氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白7A5（SLC7A5）在肺腺癌中明顯上調(diào)，與糖酵解酶GAPDH的表達(dá)呈正相關(guān)。先前的研究集中于色氨酸代謝對(duì)抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)的作用。該研究證明了通過(guò)敲除肺癌細(xì)胞中SLC7A5來(lái)抑制色氨酸攝取，導(dǎo)致細(xì)胞NAD水平降低以及糖酵解活性減弱。因此，該研究為肺腺癌的惡性轉(zhuǎn)化所關(guān)聯(lián)的血清代謝改變提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

綜上所述，該研究建立了用于肺結(jié)節(jié)鑒別診斷的血清代謝分類器，并提出了一種基于CT篩查的優(yōu)化工作流程，以便進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估并促進(jìn)臨床管理。

參考文獻(xiàn)

Metabolomic differentiation of benign vs malignant pulmonary nodules with high specificity via high-resolution mass spectrometry analysis of patient sera. Nature Communications. 2023.

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