癌癥來源的外泌體誘導巨噬細胞免疫抑制極化及促進膀胱癌進展

膀胱癌（BCa）是全球診斷出的第 10大癌癥，可分為非肌層浸潤性膀胱癌和肌層浸潤性膀胱癌。根治性膀胱切除術(shù)是非轉(zhuǎn)移性肌層浸潤性膀胱癌（MIBC）患者的標準治療方案，無需新輔助化療，但其復發(fā)率和轉(zhuǎn)移率很高。因此，明確膀胱癌進展的機制，尋找膀胱癌治療的新靶點尤為重要。
 

最近，免疫療法已被用于治療多種癌癥，但仍遠不能滿足臨床需求。腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAM）是腫瘤微環(huán)境（TME）中免疫細胞的主要成分，被認為在腫瘤進展中起核心作用。越來越多的證據(jù)表明，TAM可以通過馴化宿主適應性免疫來增加腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。有研究認為，對TAM進行腫瘤殺傷能力的再調(diào)控可能有助于膀胱癌治療。因此，迫切需要了解腫瘤進展過程中TAM在膀胱TME中的極化情況。
 

新出現(xiàn)的證據(jù)表明，腫瘤細胞和巨噬細胞之間的通訊在介導TAM極化中起著關(guān)鍵作用。源自腫瘤細胞的信號，如轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β），可促進未活化的巨噬細胞分化為TAM樣免疫抑制表型，其特征是抗炎細胞因子表達增加和促炎細胞因子表達減少。外泌體是細胞分泌的一種細胞外囊泡，其主要成分是磷脂雙分子層和攜帶相關(guān)內(nèi)容，并介導細胞之間的信息傳遞和物質(zhì)交換。因此，外泌體有助于TME中腫瘤細胞與其他基質(zhì)或免疫細胞之間的信息和物質(zhì)交換。據(jù)報道，源自TAM的外泌體可以促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移以及對化療的耐藥性。相反，膀胱癌細胞T24細胞分泌的外泌體miR-21可以通過激活PI3K-AKT-STAT3信號通路將THP-1細胞來源的巨噬細胞極化為M2表型。然而，腫瘤細胞衍生外泌體介導巨噬細胞極化的潛在機制仍未完全了解。
 

在鄭州大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科課題組的一項研究中，曾探討了膀胱腫瘤細胞衍生的外泌體如何誘導巨噬細胞極化以及對腫瘤生長的影響。實驗首先研究了小鼠膀胱細胞MB49來源的外泌體對骨髓來源巨噬細胞（BMDM）極化的影響，以及MB49來源的外泌體刺激巨噬細胞對T細胞增殖的影響，此外還研究了GW4869通過抑制外泌體的產(chǎn)生或釋放對膀胱癌生長的潛在治療功能。具體研究成果以“Cancer derived exosomes induce macrophages immunosuppressive polarization to promote bladder cancer progression”為題發(fā)表在 Cell Communication and Signaling volume 期刊。
 

首先，為研究膀胱癌細胞分泌因子對巨噬細胞極化的影響，采用MB49細胞（小鼠膀胱癌細胞）培養(yǎng)上清液處理小鼠BMDM，分析基因表達。M2相關(guān)基因的表達，包括白細胞介素-10（Il-10），Cd206和轉(zhuǎn)化生長因子β（Tgfb）增加，而M1基因 iNOS 表達降低。MB49細胞培養(yǎng)上清液介導的巨噬細胞M2極化通過F4/80+ CD206+ 巨噬細胞群的增加進一步得到驗證。這些結(jié)果表明，MB49細胞條件培養(yǎng)基（CM）可以促進BMDM向M2表型的極化。
 

然后研究了MB49細胞CM中的外泌體是否可以介導巨噬細胞M2極化。通過電子顯微鏡觀察外泌體形態(tài)（圖1 A），并檢測了外泌體標志物HSP90和CD63的表達（圖1 A）。為了研究巨噬細胞是否可以攝取MB49衍生的外泌體，將BMDM與Cy5.5標記的外泌體進行共培養(yǎng)。免疫熒光和流式細胞分析表明，MB49來源的外泌體可以被巨噬細胞攝�。▓D1 C、D）。進而通過將Cy5.5標記的MB49衍生外泌體注射到小鼠體內(nèi)研究了膀胱巨噬細胞中外泌體富集和吸收的可能性。結(jié)果顯示，膀胱F4/80+ CD11b+ 巨噬細胞中Cy5.5的平均熒光強度遠高于對照組（圖1 E）。基于上述結(jié)果，可以確認源自MB49細胞的外泌體可以在體外和體內(nèi)被巨噬細胞攝取。
 

圖1   鑒定MB49衍生的外泌體及其在巨噬細胞中的攝取。

接下來，為了進一步鑒定MB49來源外泌體對BMDM表型和功能的影響，檢測了MB49來源外泌體處理的BMDM中M1 / M2巨噬細胞標志物的基因表達水平。結(jié)果顯示，MB49來源的外泌體刺激的BMDM中Il10、Cd206和Tgfb的表達顯著增加，而M1巨噬細胞基因 iNOS 的表達降低，這說明MB49來源的外泌體可以將巨噬細胞極化為M2表型。此外，通過利用外泌體抑制劑GW4869來檢測M1 / M2巨噬細胞標志物的表達，進一步確認了M2巨噬細胞的極化是外泌體依賴性的。為了進一步研究MB49來源的外泌體極化巨噬細胞的免疫抑制功能，將MB49來源的外泌體刺激的BMDM與CFSE標記的脾臟T細胞共培養(yǎng)3天。MB49衍生的外泌體極化BMDM顯著降低了CD4+/CD8+ T 細胞的增殖，而GW4869處理逆轉(zhuǎn)了T細胞增殖的降低。這些結(jié)果表明，MB49 CM中的外泌體在將巨噬細胞極化為M2表型和免疫抑制功能中起主導作用。
 

進一步地，研究人員想知道MB49衍生的外泌體誘導的免疫抑制巨噬細胞是否會影響體內(nèi)膀胱腫瘤細胞的生長。在建立的小鼠皮下腫瘤模型中，與DMSO處理組相比，GW4869處理組的異種移植腫瘤的腫瘤/體重比和生長速度顯著較小且較慢（圖2 A-C）。而且，腫瘤中大多數(shù)巨噬細胞是M2（F4/80+ CD206+）表型，GW4869處理顯著降低了M2巨噬細胞的百分比（圖2 D）。此外，GW4869處理組CD4+ 和CD8+ T 細胞的比例顯著更高（圖2 E）。這些結(jié)果表明，MB49來源的外泌體可以通過外泌體介導的免疫抑制TME促進腫瘤細胞的生長。

圖2   MB49衍生的外泌體促進腫瘤細胞的生長。

越來越多的證據(jù)表明，外泌體miRNA具有多種功能，如促進腫瘤生長、侵襲、調(diào)節(jié)TME等。最后，為了進一步闡明MB49衍生外泌體中的miRNA譜，進行了微陣列分析�；�于MB49衍生的外泌體miRNAs靶基因，通過KEEG分析鑒定出多種癌癥相關(guān)信號通路，如PI3K-AKT通路。由于PTEN是一種腫瘤抑制因子，并且負調(diào)節(jié)PI3K-AKT信號，因此鑒定了兩種miRNAs，miR-92b-3p和miR-1231-5p，它們可以靶向Pten mRNA位點。
 

在MB49來源外泌體刺激的BMDM中PTEN的表達降低（圖3 A）。因此，p-PI3K和p-AKT顯著上調(diào)（圖3 A）。值得注意的是，p-STAT3/6也在MB49衍生的外泌體刺激后30分鐘和1小時被激活，但潛在的機制需要進一步研究。為了進一步證實miR-1231-5p或miR-92b-3p在MB49衍生的外泌體中對PTEN的抑制，分別用miR-1231-5p模擬物或miR-92b-3p模擬物或MB49衍生外泌體的每種抑制劑刺激BMDM。結(jié)果觀察到，miR-1231-5p模擬物或miR-92b-3p模擬物處理明顯降低了PTEN蛋白水平，這與MB49衍生的外泌體刺激相當。同樣，miR-1231-5p模擬物或miR-92b-3p模擬物處理增加了p-PI3K/p-AKT/p-STAT3/6 蛋白水平。此外，MB49衍生的外泌體介導的PTEN蛋白下調(diào)和p-PI3K/p-AKT/p-STAT3/6上調(diào)通過補充miR-1231-5p抑制劑或miR-92b-3p抑制劑逆轉(zhuǎn)（圖3 B）。這些數(shù)據(jù)表明，MB49衍生外泌體中所含的miR-1231-5p 和miR-92b-3p 在激活PTEN/AKT/STAT3/6通路中起關(guān)鍵作用。

基于上述結(jié)果，發(fā)現(xiàn)MB49來源的外泌體miRNAs可以通過激活PTEN/AKT/STAT3/6通路誘導巨噬細胞極化為免疫抑制表型，從而有助于建立免疫抑制TME以促進腫瘤生長。

圖3   MB49衍生的外泌體激活BMDM中的PTEN/AKT/STAT3/6信號通路。

圖4   圖形概要

MB49來源的外泌體可以被巨噬細胞攝取，從而促進巨噬細胞免疫抑制極化。機制上，MB49衍生的外泌體誘導巨噬細胞M2極化是通過PTEN的下調(diào)和AKT/STAT3/6信號的激活介導的。此外，在小鼠皮下腫瘤模型中，GW4869阻礙外泌體的產(chǎn)生或分泌可抑制巨噬細胞向免疫抑制表型和功能的分化，從而抑制腫瘤的生長。

綜上所述，該研究進一步證實了膀胱癌細胞來源的外泌體有助于建立免疫抑制性TME并促進腫瘤進展。外泌體miR-92b-3p和miR-1231-5p可能在AKT/STAT3/6信號通路的激活和誘導巨噬細胞免疫抑制分化中起至關(guān)重要的作用。此外，GW4869對外泌體的產(chǎn)生或釋放的阻礙可以通過逆轉(zhuǎn)免疫抑制TME來抑制膀胱腫瘤細胞的生長。

參考文獻：Jiang Z, Zhang Y, Zhang Y, Jia Z, Zhang Z, Yang J. Cancer derived exosomes induce macrophages immunosuppressive polarization to promote bladder cancer progression. Cell Commun Signal. 2021 Sep 14;19(1):93. doi: 10.1186/s12964-021-00768-1. PMID: 34521440; PMCID: PMC8439012.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34521440/
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