大規(guī)模寡核苷酸合成案例分享

    2020年mRNA疫苗的成功，讓核酸藥物成為整個制藥行業(yè)炙手可熱的賽道。也讓同屬于核酸藥物的小核酸藥物引起了廣泛關(guān)注。其實(shí)早在1998年，就已經(jīng)有小核酸藥物上市。至今共15款小核酸藥物獲得FDA批準(zhǔn)（其中2款A(yù)SO藥物和1款適配體藥物由于銷售額過低等原因退市）。據(jù)統(tǒng)計(jì)，自2016年到2021年全球小核酸藥物市場規(guī)模從0.1億美元已增長至32.5億美元，年復(fù)合增長率達(dá)217.8%。展示出巨大的增長潛力。

    雖然同屬于核酸藥物，mRNA和小核酸藥物的生產(chǎn)工藝大不相同。mRNA通常分子量較大，達(dá)上千nt，目前多采用以線性化質(zhì)粒為模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄（IVT）制備。而小核酸藥物主要包括反義寡核苷酸 (ASO)、小干擾RNA (siRNA)、微小RNA (miRNA)、小激活RNA (saRNA)、信使RNA (mRNA)、RNA適配 (Aptamer)，一般小于100nt，通常在20-30nt，目前制備工藝仍以固相合成工藝為主。 

    寡核苷酸合成是一個多步連續(xù)的反應(yīng)，一個循環(huán)主要包括Detritylation（脫DMT），Coupling （偶聯(lián)），Oxidation（氧化，O或S），Capping（封閉）四步反應(yīng)，每個循環(huán)增加一個核苷酸單體，要求反應(yīng)過程中的副反應(yīng)盡可能少，否則目標(biāo)產(chǎn)品的產(chǎn)率就可能很低，且純化的難度會非常大。所以每一循環(huán)的合成效率和循環(huán)數(shù)（單體數(shù)）也就直接決定了最終產(chǎn)品的純度和產(chǎn)率。

圖 1 寡核苷酸合成過程——示一個循環(huán)

     比如，同樣合成30個堿基的寡核苷酸，在每步合成效率為99.0%時，最終計(jì)算產(chǎn)率為74.72%；而如果單步收率降低至98.0%, 則最終收率會降低至55.66%。而同樣單步合成效率為99.0%時，10個單體的寡核苷酸產(chǎn)率可達(dá)91.35%，而100個單體的寡核苷酸只能獲得36.97%。所以固相合成工藝一般合成都在100個單體以內(nèi)，超過60個單體已經(jīng)是比較有挑戰(zhàn)的了。

圖 2 寡核苷酸單步偶聯(lián)效率和最終收率計(jì)算

     寡核苷酸固相合成的關(guān)鍵，包括所用試劑和單體的質(zhì)量、合成工藝參數(shù)，也與所用設(shè)備息息相關(guān)。在核酸藥物發(fā)展初期，英賽斯就敏銳的發(fā)現(xiàn)了相關(guān)市場對大規(guī)模核酸合成儀的需求，基于自有專利柱塞泵技術(shù)和對寡核酸合成工藝的研究，于2021年9月推出了Unique AutoOligo系列，目前產(chǎn)品已涵蓋AutoOligo25，AutoOligo100，AutoOligo150，以及中試規(guī)模的AutoOligo600。制備量從10μmol 到50mmol。

    產(chǎn)品上市后已廣泛應(yīng)用于DNA，RNA以及各種修飾寡核酸的合成，并成功應(yīng)用于長達(dá)85個堿基的寡核苷酸合成。 

案例分享：

案例1：21堿基甲氧氟代RNA合成，高合成效率，高純度
序列：RNA 21堿基 甲氧氟代
目標(biāo)分子量：6596.3
合成儀器：AutoOligo600
合成柱：FineLINE 35 24ml
載體信息：Nitto Phase® HL UnyLinkerTM250
合成規(guī)模：0.660mmol
單次偶聯(lián)效率：99.5%
合成純度：91.268%

圖 3 21 案例1合成色譜圖

圖 4 案例1合成質(zhì)譜

圖 5 案例1 HPLC檢測圖譜 

案例2：30堿基全硫代DNA合成
序列：DNA 30堿基 全硫代
目標(biāo)分子量：9670
合成儀器：AutoOligo100
合成柱：6.3ml合成柱
載體信息：Nitto Phase® HL UnyLinkerTM 250
合成規(guī)模：0.175mmol
單次偶聯(lián)效率：99.4%
純度：85.372%

圖 6 案例2合成色譜圖

圖 7 案例3質(zhì)譜圖

圖 8 案例2HPLC檢測圖譜

案例3：85個堿基超長RNA的合成
序列：RNA 85堿基
目標(biāo)分子量：23890
合成儀器：AutoOligo100
合成柱：6.3ml合成柱
載體信息：CPG，1.8g
合成規(guī)模：57μmol
單次偶聯(lián)效率：97.15%
得率：8.8% （純化后結(jié)果，高于對照合成設(shè)備10%）

圖 9 案例3 一步純化后質(zhì)譜圖

圖 10 一步純化后HPLC圖譜