在短波紅外光譜區(qū)域開啟對體內血管系統(tǒng)氧化還原穩(wěn)態(tài)的熒光傳感

本文要點：幾十年來，過量服用對乙酰氨基酚（APAP）一直是急性肝功能衰竭（acute liver failure, ALF）的主要原因。目前，APAP誘導的肝毒性的發(fā)病機制仍有待完全闡明。短波紅外光譜區(qū)（shortwave infrared spectral region, SWIR）功能性體內成像在疾病診斷、熒光引導手術和體內藥理學方面具有廣泛的潛力。因此，用于體內血管系統(tǒng)氧化應激的SWIR熒光探針可以為APAP毒性的發(fā)病機制提供一個獨特的視角。
 

近年來，已經(jīng)有一些關于具有SWIR區(qū)域吸收的染料的報道。然而，由于缺乏有效的熒光猝滅機制，基于這些SWIR染料的探針設計仍然很困難。本研究發(fā)現(xiàn)，利用對稱性破缺電荷轉移是一種開發(fā)具有SWIR熒光團的探針的可行方法。同源熒光共振能量轉移（homo fluorescence resonance energy transfer, homo-FRET）是一種兩個具有吸收/發(fā)射光譜串擾的相同熒光團分子間的長距離偶極-偶極熒光猝滅機制。由于缺乏熱力學驅動力，且對兩個熒光團之間的距離和取向要求嚴格，它并不是一種特別強的猝滅機制。當兩個分子接近形成剛性二聚體時，一種稱為對稱性破缺電荷轉移（symmetry-breaking charge-transfer, SBCT）的短距離超快分子內電子耦合便可起作用，將發(fā)射振動弛豫激發(fā)態(tài)轉移到一種新的、能量較低的電荷轉移態(tài)（通常是暗態(tài)）。

 

 

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七甲基菁（Cy7）是一種經(jīng)典的長波長熒光染料，它的最大吸收波長可以用不同的頭部集團來調節(jié)，例如具有苯并吲哚頭基團的IR1080，最大吸收波長約為1000nm。本研究基于IR1080合成了第一個V型不對稱菁二聚體（VAD1080）（圖1），它的兩個菁單體被鎖定在非常接近的位置，實現(xiàn)軌道重疊，從而有效地熒光猝滅。

圖1. VAD1080和IR1080的合成

 

作者首先研究了所合成的IR1080與VAD1080在CH2Cl2中的光譜特征。IR1080的吸收和發(fā)射波段具有良好的鏡像關系（圖2A-B），熒光量子產率為1.2%（以IR1061作為參考）。如圖2E-H, VAD1080的吸收光譜明顯偏離IR1080的吸收光譜，其三峰光譜特征與VAD1080的獨特傾斜結構特征一致。VAD1080仍然可發(fā)射熒光，盡管其熒光量子產率（Φ=0.08%）與IR1080相比大大降低。

 

進一步用CH2Cl2中的瞬態(tài)吸收光譜研究了VAD1080的激發(fā)態(tài)動力學，并與IR1080的激發(fā)態(tài)進行了比較，以闡明熒光猝滅的光物理起源。在激發(fā)時，觀察到IR1080的基態(tài)漂白（ground state bleaching , GSB）和受激發(fā)射（stimulated emission, SE）。在接下來的100ps左右，GSB信號以自發(fā)發(fā)射的方式恢復。根據(jù)GSB和SE的信號通過非線性擬合計算出兩個壽命，即溶劑化/振動弛豫可能為1.4ps，熒光為33ps；而對于VAD1080，其GSB信號經(jīng)歷了從1047nm到1000nm的光譜偏移，表現(xiàn)出存在壽命為0.6ps的快速激發(fā)態(tài)路徑，可能進入壽命為6.5ps的暗對稱性破缺電荷轉移態(tài)。由此驗證了SCBT是SWIR菁染料可行的熒光猝滅機制。

圖2. IR1080和VAD1080在CH2Cl2中的光譜特征。（A–D）IR1080的UV-Vis吸收、熒光發(fā)射光譜以及去卷積吸收和發(fā)射光譜。（E–H）VAD1080的UV-Vis吸收、熒光發(fā)射光譜以及去卷積吸收和發(fā)射光譜。（I）IR1080的兩個不同波長的瞬態(tài)吸收光譜和（J）激發(fā)態(tài)動力學。（K）VAD1080的兩個不同波長的瞬態(tài)吸收光譜和（L）激發(fā)態(tài)動力學。

 

已知IR1080的多甲基甲酰胺易于被親核活性氧物種破壞，例如與病理性氧化應激有關的ONOO-、ClO-和H2O2。作者設想，VAD1080菁支架的破壞將去除SCBT途徑，從而恢復剩余菁骨架的SWIR發(fā)射（圖3A）。因此，VAD1080可能是一種可用于氧化應激的開啟熒光探針。

為了評估策略的可行性，作者首先研究了VAD1080在DMF水溶液（v/v=1:1）中對ONOO-的反應性。探針溶液的吸光度為0.6，隨著ONOO-當量的增加而連續(xù)下降。這與所提出的ONOO-氧化裂解VAD1080結合主鏈的機制不一致（圖3B）。基于熒光的滴定的趨勢則有所不同。當ONOO-的濃度從0μM逐漸增加到11μM時，溶液在1004nm處的熒光強度達到峰值，增強了61倍。據(jù)推測，這是由于VAD1080的兩個菁主鏈中的一個被切割，消除了通過SCBT的熒光猝滅，導致熒光顯著增加；而進一步添加ONOO-（11–21μM）則導致熒光強度逐漸降低，這可能是由于剩余的菁染料被過量的氧化物種破壞，熒光隨之消失（圖3C）。這顯然不符合預期，但如此高濃度的氧化物種從生物學角度來看是無需考慮的。

接著還研究了VAD1080和ONOO-之間的反應動力學，反應在約100s內完成（圖3D）。進一步測試發(fā)現(xiàn)VAD1080也對其他高氧化物種（如ClO-和·OH）表現(xiàn)出高熒光開啟反應，而生理水平的生物硫醇與溫和的反應性物質（如H2O2）不會導致熒光開啟（圖3E）。這些結果證實VAD1080可用于高氧化性物種的生物傳感。

圖3.（A）VAD1080對氧化物種的檢測機制。（B）在H2O:DMF（v/v =1:1，含1%TFA）的混合物中，VAD1080（20μM）對ONOO-的吸收滴定和（C）熒光滴定。λex=940 nm。（D）VAD1080（20μM）與ONOO-的反應動力學。（E） VAD1080（20μM）對各種生物硫化物（每個物種5當量）和不同氧化物種的熒光響應。（H2O2：5當量；·OH：1當量；ClO-：0.5當量；ONOO-：0.5當量。）

 

最后，作者在小鼠模型中展示了對APAP誘導的氧爆作用的實時體內熒光成像的概念驗證應用。用DSPE-PEG2000磷脂膠束包封VAD1080，以提高其在PBS中的溶解度。對照組小鼠靜脈注射PBS和VAD1080膠束；接下來的三組依次注射不同劑量的APAP以及VAD1080；最后一組小鼠注射APAP（300 mg/kg）、N-乙酰半胱氨酸（NAC，300 mg/kg）和VAD1080。在第一個60分鐘內，在對照組的脈管系統(tǒng)中觀察到微弱信號（圖4a，第1行）。肝臟中的信號在60分鐘內變得明顯，并在隨后的幾個小時內逐漸增強。注射150 mg/kg低劑量APAP的小鼠具有良好的耐受性，血管系統(tǒng)或肝臟中沒有熒光發(fā)射的明顯增強（圖4a，第2行）。用高劑量APAP處理的小鼠的熒光強度產生了明顯更強的劑量依賴性熒光信號，表明發(fā)生了氧化應激（圖4a，第3/4行）。這種氧化應激可以通過注射N-乙酰半胱氨酸（NAC）來抑制（圖4a，第5行）。肝臟熒光開啟的動力學與APAP誘導肝損傷的相關文獻中所報道的一致。因此，本研究中肝臟熒光強度是肝臟氧化損傷的良好指標。

作者分析，肝臟中的熒光開啟可能是肝臟中探針直接氧化和肝臟中遠端生成的氧化產物積累的綜合結果，而兩者都與血管系統(tǒng)的氧化應激有關。有趣的是，在第一個小時內熒光開啟主要在脈管系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)，而肝臟中的信號直到60分鐘后才開始積累（圖4A, C）。這似乎表明APAP首先誘導了血管系統(tǒng)中的氧化。根據(jù)先前的文獻，在APAP給藥的早期階段（約1小時），ONOO-確實會在正弦內皮細胞中產生，導致酪氨酸的硝化，從而對血管造成損傷。免疫組織化學實驗結果也證明了這一觀點（圖4B）。血管系統(tǒng)的持續(xù)氧化應激最終導致肝臟中的氧化應激和組織損傷，正如肝臟中硝基酪氨酸（NT）蛋白加合物的免疫組織化學染色所反映的（圖4D），而NAC可以抑制NT蛋白加合物的存在。

 

總之，本研究開發(fā)了一種用于SWIR區(qū)域吸收的菁染料“off-on”型熒光探針的設計原理，設計了一種獨特的V形不對稱菁二聚體。由于其苯并吲哚頭基的平坦性質，兩個菁單體的近端堆疊在一起，以促進SBCT。這種SBCT是一個ps級的快速過程，可以有效地與輻射衰變競爭，并有效地猝滅SWIR染料的熒光。在與ONOO-反應時，VAD1080兩種構成菁染料的頭基可以被裂解，以抑制SBCT過程并恢復剩余菁熒光團的SWIR熒光。用APAP處理的小鼠展示了VAD1080在體內傳感氧化應激的可行性。并且發(fā)現(xiàn)血管系統(tǒng)中的氧化爆發(fā)先于肝臟中的氧化爆發(fā)。本研究為APAP的毒理學提供了新的見解，為APAP過量的干預提供了措施。

 

參考文獻

Wang, M.; Wang, X.; Wei, R.; Zhang, Y.; Chen, J.; Luo, X.; Qian, X.; Yang, Y., Symmetry-breaking charge-transfer enables turn-on fluorescence sensing in the shortwave infrared spectral region for in vivo vasculature redox homeostasis. Sensors and Actuators B: Chemical 2023, 394.

 

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