單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序與類器官聯(lián)合在HPV病毒研究中的新思路

感染高危型人乳頭瘤病毒(HPV)導(dǎo)致全世界5%的癌癥，包括宮頸癌和口咽癌。HPV16占大多數(shù)，并且持續(xù)的角質(zhì)形成細(xì)胞感染是主要的危險(xiǎn)因素。病毒癌基因在人類致癌中的作用已經(jīng)被深入研究了幾十年，分化對(duì)病毒生命周期的重要性是已知的。病毒的生命周期依賴于復(fù)層鱗狀上皮的分化程序，但支持病毒生命周期不同階段的角質(zhì)形成細(xì)胞亞群的格局尚未闡明。在2023年4月，發(fā)表在Nature Communications上的“Single cell transcriptomic analysis of HPV16-infected epithelium identifies a keratinocyte subpopulation implicated in cancer”一文（中文題目：HPV16感染上皮的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄分析確定與癌癥有關(guān)的角質(zhì)形成細(xì)胞亞群）中，研究者構(gòu)建類器官并進(jìn)行單細(xì)胞測序共識(shí)別出12個(gè)不同的角質(zhì)形成細(xì)胞群，其中一個(gè)亞群被映射以重建它們?cè)趶?fù)層鱗狀上皮中各自的三維位置。研究發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)的終末分化細(xì)胞不同，HPV重新編程的角質(zhì)形成細(xì)胞亞群(HIDDEN細(xì)胞)形成了表面區(qū)域，并需要ELF3/ESE-1轉(zhuǎn)錄因子的過度表達(dá)。
 

Visual summary

 

技術(shù)路線

 

研究內(nèi)容

1. scRNAseq 揭示了 HPV16+ 與 HPV16− 復(fù)層鱗狀上皮raft中不同角質(zhì)形成細(xì)胞亞群的富集

研究者首先從HPV+ 和 HPV- 靠近形成皮膚的二倍體永生化角質(zhì)形成細(xì)胞 (NIKS)構(gòu)建了3D類器官raft，隨后研究者對(duì)構(gòu)建成功的HPV+ raft和 HPV- raft進(jìn)行了單細(xì)胞測序，形成了12個(gè)角質(zhì)形成細(xì)胞亞群(C0-C11)。其中C9 與其余 11 個(gè)簇唯一分離，并且在 HPV16+ 細(xì)胞中高度富集，3個(gè)簇 (C4、C5 和 C7) 富含 HPV16- 細(xì)胞，除 C9 外，C6 亞群也富含 HPV16+ rafts，而 C8 亞群只存在于 HPV16+ rafts中。

圖1 HPV16+ raft與HPV16- raft的產(chǎn)生
 

圖2 HPV16+ raft與HPV16- raft單細(xì)胞測序分群展示

 

2. 角質(zhì)形成細(xì)胞亞群主要由分層鱗狀上皮的分化程序來定義

研究者進(jìn)行了擬時(shí)序分析發(fā)現(xiàn)，除了C9，其他所有角質(zhì)形成細(xì)胞亞群都沿著鱗狀上皮分化程序連續(xù)排列。依據(jù)基因表達(dá)特征，細(xì)胞亞群也顯示出基底細(xì)胞（C10、C7、C6、C4 和 C5）或分化細(xì)胞特征（C1、C8、C0、C11、C2 和C3)。IHC 染色檢查 HPV16- 和 HPV16+  raft中特異性標(biāo)記物的蛋白質(zhì)表達(dá)顯示也與之前一致。然而，值得注意的是，HPV16+ 上皮細(xì)胞的分化標(biāo)記物染色強(qiáng)度較低，表明 HPV 重編程抑制了正常的分化程序，特別是在上皮細(xì)胞的最上層。、
 

圖3 擬時(shí)序分析使細(xì)胞沿著三維分層上皮的分化程序排列

 

3. 基底上細(xì)胞簇的空間映射揭示了 HPV16+ raft中尚未描述的上皮區(qū)域

由于scRNA-seq不能識(shí)別空間位置信息，因此研究者使用 RNA-ISH來定位選定的角質(zhì)形成細(xì)胞亞群。鑒于在基底上HPV+ vs HPV- raft中觀察到的差異蛋白染色，最上面的分化亞群特別令人感興趣。他們假設(shè)地理分布的差異可能反映了HPV 的轉(zhuǎn)錄重編程，并且也是圖 3f 中觀察到的蛋白質(zhì)水平變化的基礎(chǔ)。為此，C3被確定為最終末分化的細(xì)胞亞群。

之后研究者依據(jù)自己的篩選標(biāo)準(zhǔn)試圖識(shí)別“聚類定義基因”，這些基因可以作為生物標(biāo)志物，獨(dú)立地表示聚類。他們確定了用于C2（C10orf99 和 DSG1）和C3（KLK7、SPRR1A、RDH12 和 POF1B）兩個(gè)群中的基因。接下來，研究者發(fā)現(xiàn)終末分化的 C2 和 C3 角質(zhì)形成細(xì)胞亞群在亞匯合單層培養(yǎng)物中基本上不存在，并且它們的形成需要上皮分化程序。RNA-ISH空間映射和C3生物標(biāo)志物KLK7用于定位raft中的這種分化亞群。他們發(fā)現(xiàn)KLK7在 HPV+ 與 HPV- rafts 中的定位具有差異，表明HPV16+ rafts中基底上簇的失調(diào)。雖然KLK7+ C3細(xì)胞位于HPV16- rafts的最上層，但HPV16+ rafts在KLK7+細(xì)胞上方還有一個(gè)額外的區(qū)域（紅標(biāo)記線，圖 4e）。
 

圖4 分層鱗狀上皮中終末分化的 KLK7+ C3 角質(zhì)形成細(xì)胞亞群的空間定位

 

4. C9轉(zhuǎn)錄組定義了一個(gè)分化不協(xié)調(diào)的角質(zhì)形成細(xì)胞亞群，該亞群形成了HPV16+raft的最上層

研究者識(shí)別并可視化了C9簇的生物標(biāo)記物，包括ELF3、GPR110和Lcn2。相對(duì)于未分化（亞融合）細(xì)胞，C9 細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)在分化模型（過度融合細(xì)胞和raft）中增加。因此它仍然依賴于分化程序，研究者決定在復(fù)層上皮模型中進(jìn)行研究。研究者用C9 簇標(biāo)記物的 RNA-ISH 將這個(gè)群體定位到最上層的基底上區(qū)域，在 HPV16+ raft的許多細(xì)胞中具有強(qiáng)烈的染色。IF顯示ELF3 和 LCN2 蛋白定位于 HPV16+ rafts 的最上層區(qū)域，而在 HPV16- rafts 中基本不存在。之后研究者應(yīng)用通路分析和轉(zhuǎn)錄因子分析顯示病毒發(fā)病機(jī)制和鱗狀細(xì)胞分化的重要性。為了捕捉 C9 轉(zhuǎn)錄組的這些特征，他們將 C9 亞群稱為 HPV 誘導(dǎo)的分化不協(xié)調(diào)上皮非常規(guī) (HIDDEN) 細(xì)胞。

 

圖5 C9細(xì)胞占據(jù)HPV16+上皮的淺表細(xì)胞層

 

5. HPV+宮頸raft中HIDDEN細(xì)胞上調(diào)

研究者使用了由原代宮頸角質(zhì)形成細(xì)胞設(shè)計(jì)的器官型上皮raft（感染了HPV18的HPV+和HPV-）。通過 RNA-ISH和 IF檢測到許多強(qiáng)烈染色的 ELF3+ 基底上細(xì)胞。這表明 (1) 在健康宮頸上皮細(xì)胞的基線觀察到很少的 ELF3+ 細(xì)胞，(2) HIDDEN 細(xì)胞在宮頸上皮細(xì)胞中被 HPV 高度上調(diào)，以及 (3) 其他高危 HPV 類型如 HPV18 也誘導(dǎo) HIDDEN細(xì)胞區(qū)域。

 

6. 在HPV驅(qū)動(dòng)的宮頸癌發(fā)生的各個(gè)階段都檢測到HIDDEN細(xì)胞

研究者試圖評(píng)估在宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)的不同階段。一般來說，CIN1病灶包含病毒片段，而CIN2和CIN3含有片段和整合的病毒基因組，存在異常增生并發(fā)展為宮頸鱗狀細(xì)胞癌（SCC）。研究者收集、處理和篩查疑似宮頸上皮內(nèi)瘤變患者的宮頸活檢組織中的高危HPV標(biāo)志物p16。隨后IF染色以尋找HIDDEN細(xì)胞生物標(biāo)記物ELF3。結(jié)果顯示：ELF3蛋白在正常宮頸外上皮組織中低表達(dá)或檢測不到。但p16+基底細(xì)胞上方的組織顯示出ELF3的強(qiáng)烈染色。這包括具有 HPV 特征和 CIN 病變的組織，無論等級(jí)如何。在具有 CIN 病變的組織的某些區(qū)域中，觀察到 ELF3 染色在中間區(qū)域中更強(qiáng)烈，而在更淺表的細(xì)胞中染色強(qiáng)度較低（CIN1）。盡管如此，在所有 p16+ 組織中，HIDDEN 細(xì)胞都得到了極大的擴(kuò)增。
 

圖6 在HPV陽性宮頸raft和宮頸癌前病變中檢測到HIDDEN細(xì)胞
 

7. HIDDEN細(xì)胞生物標(biāo)志物在HPV+SCC腫瘤中升高

由于發(fā)現(xiàn) HIDDEN 細(xì)胞持續(xù)存在于癌前宮頸組織 (CIN1-3) 的所有階段，研究者提出 HIDDEN 細(xì)胞從癌前病變進(jìn)一步持續(xù)存在到惡性鱗狀細(xì)胞癌中。因此研究者分析了 PanCancer TCGA 以確定癌癥中HIDDEN細(xì)胞生物標(biāo)志物的表達(dá)。在可供分析的 488 名 HNSCC 患者中，與其余患者相比，9% 的 ELF3 表達(dá)顯著升高 (z ≥ 2.0)。重要的是，該患者亞組在 HPV 狀態(tài)、國際疾病分類 (ICD)-10 分類（指示解剖位置）、染色體 1q 異常和缺氧評(píng)分方面具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。接下來研究者在HPV+ vs HPV- HNSCC 中探究了ELF3 的表達(dá)，也檢測了按 ICD-10 分組的 HNSCC 中的 ELF3 mRNA 的水平。以上結(jié)果支持在 HPV+ 疾病過程（包括癌癥）中存在 ELF3 驅(qū)動(dòng)的分化鱗狀細(xì)胞亞群。

隨后研究者使用TCGA 數(shù)據(jù)集中的大型 HNSCC 和宮頸 SCC 患者隊(duì)列改進(jìn) HIDDEN 細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，以識(shí)別強(qiáng)有力的共生生物標(biāo)志物，用于檢測 SCC 中的類似群體。
 

圖7 ELF3 依賴性 C9 細(xì)胞群與 HPV+ 頭頸和宮頸 SCC 相關(guān)

 

8. 在已發(fā)表的 HNSCC scRNAseq 數(shù)據(jù)中檢測到 HPV+HIDDEN 細(xì)胞特征

為了在獨(dú)立數(shù)據(jù)集中驗(yàn)證上述特征，研究者分析了9個(gè) HPV- 和6個(gè) HPV+HNSCC 腫瘤的已發(fā)表 scRNAseq 數(shù)據(jù)，并證實(shí)了 HIDDEN 細(xì)胞的存在且在HPV+中增加。
 

圖8 在HPV+和HPV - HNSCC scRNAseq數(shù)據(jù)中檢測到HIDDEN細(xì)胞

 

9. HIDDEN細(xì)胞在HPV+扁桃體raft和HPV+HNSCC患者活檢組織中富集

研究者檢查了HPV 感染和轉(zhuǎn)化的頭頸部組織中HIDDEN細(xì)胞是否存在。初級(jí)扁桃體上皮被用作口咽部 HPV 感染的模型。研究者通過檢測HPV+和HPV -raft中 ELF3 和 GPR110發(fā)現(xiàn) HPV+中HIDDEN 細(xì)胞顯著上調(diào)。研究者也對(duì) HNSCC 患者活組織進(jìn)行了同樣檢查并具有同樣發(fā)現(xiàn)。
 

圖9 在 HPV+ 扁桃體衍生的上皮細(xì)胞和 HNSCC 患者活檢組織中檢測到HIDDEN細(xì)胞

 

10. ELF3 敲低抑制HPV16+上皮raft中的HIDDEN細(xì)胞

研究者在 HPV16+ NIKS 中敲低ELF3并用于生成raft。結(jié)果顯示，ELF3 敲低幾乎完全消除了 HPV+ raft最上層區(qū)域中的 ELF3+ HIDDEN 細(xì)胞，且HIDDEN 上皮亞群中與 ELF3 共表達(dá)的基因表達(dá)減少。這些數(shù)據(jù)表明，ELF3轉(zhuǎn)錄因子是分層 HPV16 感染上皮中基底上層HIDDEN細(xì)胞區(qū)室的形成和/或維持所必需的。
 

圖10 HIDDEN 細(xì)胞區(qū)需要 ELF3 表達(dá)

 

主要結(jié)論

1. 報(bào)告了高危 HPV 感染的分層上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)景觀；

2. 發(fā)現(xiàn)了形成隔室并有可能標(biāo)記 HPV 感染組織表面的上皮HIDDEN細(xì)胞；

3. 鑒定了 ELF3作為 HIDDEN 區(qū)域所需的 HPV 誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄驅(qū)動(dòng)因子；

4. 檢測 HPV+ SCC 中的 HIDDEN 細(xì)胞富集并與預(yù)后不良相關(guān)聯(lián)。