利用超長(zhǎng)距離分子堆疊工程N(yùn)IR-II熒光團(tuán)實(shí)現(xiàn)對(duì)深部病變的高對(duì)比度識(shí)別
本文要點(diǎn)：與熒光成像的經(jīng)典光譜范圍（低于900 nm）相比，近紅外二區(qū)（NIR-II，900-1880 nm）窗口具有中等的光吸收、較少的光子散射和最小化的組織自發(fā)熒光，為活體深度信號(hào)的高保真檢測(cè)提供了潛在的可能。然而，NIR-II熒光團(tuán)的有限信號(hào)和散射光子引起的強(qiáng)背景使在深部組織受到干擾的情況下進(jìn)行體內(nèi)高對(duì)比度熒光成像仍然具有挑戰(zhàn)性。為了實(shí)現(xiàn)具有更高對(duì)比度的深度生物成像，有必要在明亮的染料和背景抑制的成像窗口之間進(jìn)行匹配，以實(shí)現(xiàn)更高性能的NIR-II熒光成像。
本研究通過(guò)增強(qiáng)給電子能力、減少供體-受體（D-A）距離合成了一種NIR-II熒光小分子，具有聚集誘導(dǎo)發(fā)射特性和高亮度，且最大發(fā)射超過(guò)1200nm，是一種稀缺的明亮長(zhǎng)波長(zhǎng)發(fā)射有機(jī)染料。所設(shè)計(jì)的納米熒光團(tuán)具有延伸至1900nm的明亮熒光信號(hào)，與背景抑制成像窗口相匹配，使組織圖像的信噪比達(dá)到100以上，組織穿透厚度約為4-6 mm。此外，幾乎可以在零背景下識(shí)別出強(qiáng)烈負(fù)染的管腔內(nèi)病變。該方法可以為未來(lái)長(zhǎng)波長(zhǎng)NIR-II分子設(shè)計(jì)和深度、高散射組織的生物醫(yī)學(xué)成像提供新的途徑。
作者從先前報(bào)道的優(yōu)良分子2TT-oCB開(kāi)始，通過(guò)分子轉(zhuǎn)子工程設(shè)計(jì)了三種染料（圖1a）。從2TT-oCB到2MTT-oCB，引入了甲氧基電子供體基團(tuán)，增強(qiáng)了給電子能力和D-A相互作用；從2MTT-oCB到2MPT-oCB，去除了三苯胺中的苯基從而顯著縮短D-A距離；最后設(shè)計(jì)了具有電子供體芴單元的2FT-oCB來(lái)調(diào)節(jié)D-A相互作用。此外，還設(shè)計(jì)了BBTD的受體核，當(dāng)與電子供體耦合時(shí)，中心BBTD核心的強(qiáng)吸電子能力可以將吸收/發(fā)射驅(qū)動(dòng)到長(zhǎng)波長(zhǎng)范圍。圖1b中顯示了2FT-oCB高度扭曲的分子結(jié)構(gòu)，在分子堆積狀態(tài)下可見(jiàn)2FT-oCB分子傾向于以~8.5Å的超長(zhǎng)距離平行分布，有效地減少了分子間的相互作用。
接著作者研究了四種染料在四氫呋喃（THF）溶液中的光物理性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)增加供體能力和修剪π橋可以有效地增強(qiáng)D-A相互作用，不僅可以使最大吸收波長(zhǎng)紅移，而且可以提高吸收強(qiáng)度。所設(shè)計(jì)的染料可作為NIR-II發(fā)射器用于深層組織可視化（圖1c-d）。
本研究中的染料分子具有聚集誘導(dǎo)發(fā)射（aggregation-induced emission, AIE）性質(zhì)，即在稀溶液中幾乎沒(méi)有發(fā)射，但在濃縮或聚集狀態(tài)下顯示出明亮的發(fā)射。為研究聚集態(tài)下的熒光性質(zhì)，對(duì)染料在具有不同水分?jǐn)?shù)（ƒw）的THF/水混合物中的光致發(fā)光（PL）光譜進(jìn)行了研究。如圖1e所示，當(dāng)ƒw從0增加到40%，染料的PL強(qiáng)度下降，這是由于形成了暗扭曲的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移態(tài)；而隨著ƒw從40%增加到90%，PL強(qiáng)度顯著增加，這是因?yàn)橥ㄟ^(guò)聚集形成限制分子內(nèi)運(yùn)動(dòng)的機(jī)制觸發(fā)了AIE效應(yīng)。值得注意的是，本工作中的分子（特別是2MPT-oCB和2FT-oCB）可以被列為具有最長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng)的AIE分子之一。
為了進(jìn)一步研究染料的熒光性質(zhì)，作者使用生物相容性表面活性劑Pluronic F-127通過(guò)納米沉淀法將染料封裝成熒光點(diǎn)（圖2a）。除了2MPT-oCBdots外，其他3種染料點(diǎn)相較于溶液狀態(tài)均顯示出最大吸收波長(zhǎng)紅移（圖2b）；這些熒光點(diǎn)分別在NIR-II區(qū)域顯示熒光，比它們的溶液狀態(tài)稍微藍(lán)移（圖2c）。2MPT-oCB和2FT-oCB點(diǎn)優(yōu)異的吸收（>840nm）和發(fā)射（>1100nm）特性特別有利于高質(zhì)量的生物成像。使用七種不同的長(zhǎng)通（LP）濾光片記錄具有相同濃度的4種染料點(diǎn)的熒光圖像（圖2d）。隨著濾光片波長(zhǎng)從1100增加到1500nm，在2FT-oCB點(diǎn)中始終觀察到強(qiáng)烈的熒光信號(hào)，且在1400nm LP濾光片下具有最強(qiáng)的熒光強(qiáng)度。因此，選擇2FT-oCB點(diǎn)用作接下來(lái)的體內(nèi)成像。
以1,2-二氯乙烷（0.5%）中的IR-26為參考，超過(guò)900nm的2FT-oCB點(diǎn)的QY為~0.95%，超過(guò)1400nm的QY為~0.11%（圖2e）。F-127涂覆的2FT-oCB測(cè)量直徑約為50nm（圖2f）。在連續(xù)激光照射30分鐘后，2FT-oCB點(diǎn)幾乎沒(méi)有顯示出熒光強(qiáng)度的下降（圖2g），證明它具有優(yōu)異的光穩(wěn)定性。
為確定NIR-II熒光非峰成像的最佳高通檢測(cè)區(qū)域，考慮到水中2FT-oCB點(diǎn)的發(fā)射光譜和水的光吸收特性（圖3a），通過(guò)蒙特卡羅方法模擬了垂直線樣品在作為背景的水平線上1300-1700 nm范圍內(nèi)的成像（圖3b）。計(jì)算的變異系數(shù)（Cv）顯示， NIR-IIx+ NIR-IIb（1400-1700 nm）圖像的擴(kuò)散抑制效果最好。接著在靜脈注射1×2FT-oCB點(diǎn)的磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）溶液后，對(duì)小鼠進(jìn)行全身血管成像。結(jié)果顯示，1400LP收集抑制了強(qiáng)背景，使血管網(wǎng)絡(luò)輪廓清晰（圖3c–e），肝臟上方的血管顯示出1.27的最佳信噪比（圖3f）。在快速傅立葉變換（fast Fourier transform, FFT）的結(jié)果中可以看出圖像不同區(qū)域的空間頻率分布（圖3g–i）。高空間頻率的強(qiáng)度與受約束的光子散射近似正相關(guān)，且在光吸收峰值波長(zhǎng)附近出現(xiàn)最大值（圖3j）。由于水在~1450 nm處的強(qiáng)烈光吸收，由散射成分產(chǎn)生的背景被高度抑制，導(dǎo)致NIR-IIx+ NIR-IIb圖像有更高的空間頻率，甚至比一直被認(rèn)為質(zhì)量最好的NIR-IIb圖像更高。
在生物相容性實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，2FT-oCB點(diǎn)沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的毒性跡象。通過(guò)分析水和重水的典型吸收光譜發(fā)現(xiàn)，以水作為溶劑會(huì)導(dǎo)致NIR-II區(qū)域的熒光損失，而2FT-oCB dots在重水中的分散能夠恢復(fù)1450nm附近的發(fā)射損耗，因此通過(guò)超濾后重新洗脫濃縮2FT-oCB dots制得重水分散體。在此基礎(chǔ)上，作者進(jìn)行了體內(nèi)熒光結(jié)腸、膀胱和子宮成像。
結(jié)腸灌注重水分散的2FT-oCB dots后，在NIR-II區(qū)域的不同成像窗口中進(jìn)行熒光結(jié)腸造影。（圖4a，補(bǔ)充圖44）。所提出的NIR-IIx+ NIR-IIb檢測(cè)的非侵入性成像模式，即使在嚴(yán)重組織紊亂的3-6mm深度下，也能提供接近50的SBR（~46.6）（圖4b）。為了從成像背景定量劃分目標(biāo)區(qū)域，使用三個(gè)閾值（TH=0.27、0.32和0.37，表示所選區(qū)域中最高亮度的27%、32%和37%被設(shè)置為信號(hào)/背景確定的閾值），通過(guò)二值化處理所選原始結(jié)果（圖4c）�？傮w趨勢(shì)是，計(jì)算面積隨著成像波長(zhǎng)的紅移而縮小（圖4d）。將計(jì)算出的分割結(jié)腸的平均強(qiáng)度作為信號(hào)，將其余部分的平均強(qiáng)度視為背景來(lái)確定面積SBR，可得SBR值在1400LP收集時(shí)達(dá)到最大值。
膀胱內(nèi)滴注重水分散的2FT-oCB點(diǎn)后，通過(guò)皮膚和肌肉進(jìn)行NIR-II熒光膀胱造影。將膀胱的非侵入性NIR-II熒光圖像設(shè)置為綠色通道（圖4e）。組織深度為2-3 mm的情況下， NIR-IIx+ NIR-IIb熒光膀胱圖像的SBR達(dá)到~46.5（圖4f）。二進(jìn)制和分割膀胱圖像表明NIR-IIx+ NIR-IIb光譜窗口最小化了散射干擾（圖4g）。膀胱信號(hào)面積和面積SBR的計(jì)算值還證明了1400-1700 nm的成像性能最佳（圖4h）。此外，將打開(kāi)腹部后的膀胱圖像設(shè)置為紅色通道進(jìn)行比較，然后將綠色和紅色圖像合并為一個(gè)圖像，并將一致性高的區(qū)域顯示為黃色，并通過(guò)結(jié)構(gòu)相似性指數(shù)測(cè)度（structural similarity index measure, SSIM）進(jìn)行精確量化以幫助圖像質(zhì)量評(píng)估（圖4i）。1400-1700 nm的合并膀胱圖像顯示出最佳匹配，并且性能超過(guò)NIR-IIb區(qū)域。整個(gè)SSIM圖中的平均SSIM指數(shù)如圖4j所示。隨著成像窗口的延長(zhǎng)，SSIM指數(shù)逐漸提高，在1400-1700 nm圖譜上達(dá)到峰值，與NIR-II非侵入性可視化中的NIR-IIx+ NIRIIb檢測(cè)具有最高的一致性。
不同NIR-II光譜區(qū)域中2FT-oCB點(diǎn)結(jié)腸灌注的熒光結(jié)腸造影圖像（比例尺，5mm）。
子宮灌注重水分散的2FT-oCB dots后，將小鼠下腹暴露于793nm連續(xù)波（CW）激光的照射下。NIR-II及NIR-IIx+ NIRIIb熒光子宮圖像分別如補(bǔ)充圖55a、圖5a所示。即使組織厚度為4-6 mm，1400 nm LP圖像也能提供最佳成像質(zhì)量（圖5b），且1400-1700 nm窗口提供了最精確的區(qū)域分割和最高的面積SBR值（圖5c）。在NIR-IIx+ NIR-IIb圖像中，右子宮直徑計(jì)算值的FWHM最小，為1.69mm（圖5d）。
之后，作者發(fā)現(xiàn)利用2FT-oCB dots可以實(shí)現(xiàn)幾乎為零背景的精確宮內(nèi)殘留物檢測(cè)。在吸收峰周?chē)墓庾V區(qū)域內(nèi)，水的光吸收將耗盡散射光子，而殘留組織往往富含水，這導(dǎo)致光吸收而在明亮信號(hào)周?chē)a(chǎn)生強(qiáng)烈的陰性染色，可以為進(jìn)一步診斷提供鮮明的對(duì)比。將超吸收性樹(shù)脂填充到子宮腔中，充當(dāng)微小異物（圖5e）。在腹部縫合和宮內(nèi)注射重水分散的2FT-oCB dots后進(jìn)行體內(nèi)成像（圖5f）。結(jié)果如圖5g所示，隨著子宮蠕動(dòng)和輔助按壓，組織深度以及組織中斷減少，宮內(nèi)異物越來(lái)越清晰可見(jiàn)。
為了更好地模擬內(nèi)源性殘留物，使用了一批懷孕小鼠（圖5h）。在宮內(nèi)注射重水分散的2FT-oCB dots后，可以清楚地顯示子宮中具有強(qiáng)陰性染色的胎兒（圖5i–k）。將1300LP、1400LP和1500LP圖像放入三個(gè)通道，分別進(jìn)行紅色、綠色和藍(lán)色的偽彩色增強(qiáng)。三個(gè)通道的合并圖像通常顯示由三原色整合的白色（圖5l）。然而，離重疊結(jié)構(gòu)的中心越遠(yuǎn)，合并的顏色從白色逐漸加深到紫色，說(shuō)明1300LP和1500LP通道中有相對(duì)較高的光擴(kuò)散。如圖5m 所示，NIR-IIx+ NIR-IIb檢測(cè)可以準(zhǔn)確勾勒胎盤(pán)輪廓。
然后，進(jìn)一步進(jìn)行漏流產(chǎn)的檢測(cè)。在注射脂多糖后第6天，小鼠在宮內(nèi)灌注重水分散的2FT-oCB dots后成像。從圖5n所示的體內(nèi)NIR-IIx+ NIR-IIb圖像中，可以在右側(cè)子宮中觀察到胎兒，并且可以在左側(cè)子宮中精確檢測(cè)到一些殘留的妊娠組織。由于殘留的妊娠組織含有大量的水，組織背景在NIR-IIx+ NIR-IIb窗口中被有效抑制，導(dǎo)致強(qiáng)烈的陰性染色。根據(jù)圖5n中的分析， SBR計(jì)算值超過(guò)100。在輕微的輔助按壓和適當(dāng)?shù)奈恢谜{(diào)整后，組織阻塞改善，右子宮中的胎兒變得更加清晰（圖5o）。比較打開(kāi)腹部之前（圖5n，o）和之后（圖5p）的圖像，可知皮膚和脂肪組織的阻礙不會(huì)干擾NIR-IIx+ NIR-IIb檢測(cè)的精確診斷。最后，進(jìn)一步切開(kāi)子宮進(jìn)行切片和H&E染色（見(jiàn)圖5q）。右側(cè)子宮的切片圖像顯示了小鼠胎兒的完整結(jié)構(gòu)（圖5r），而左側(cè)則包含一團(tuán)殘留的妊娠組織（圖5s），與體內(nèi)NIR-IIx+ NIRIIb觀察結(jié)果一致。這表明明亮的NIR-IIx+ NIR-IIb發(fā)射和周?chē)鷱?qiáng)陰性染色的熒光團(tuán)的有效標(biāo)記光吸收峰組成雙可視化，為準(zhǔn)確診斷宮內(nèi)殘留提供了強(qiáng)有力的工具。
子宮灌注2FT-oCB點(diǎn)的熒光子宮造影圖像。比例尺，5mm。插圖中提高了亮度。比例尺，3mm。
總之，所合成的2FT-oCB dots可以被列為少數(shù)同時(shí)實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)波長(zhǎng)光學(xué)響應(yīng)、強(qiáng)光吸收和超過(guò)1400/1500nm的高QY的熒光團(tuán)之一，可作為長(zhǎng)波長(zhǎng)生物醫(yī)學(xué)熒光成像的潛在候選者，本研究的發(fā)現(xiàn)將為進(jìn)一步的熒光團(tuán)制備和生物醫(yī)學(xué)研究帶來(lái)變革。
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