使用安捷倫 Seahorse XF 實時 ATP 速率測定試劑盒檢測代謝調(diào)節(jié)

 
摘要
細胞生物能量代謝的調(diào)控被視為癌細胞增殖的關鍵驅動因素。鑒別調(diào)節(jié)生物能量代謝的關鍵通路是一種開發(fā)用于癌癥治療的新治療靶標的頗具前景的策略。對活細胞中糖酵解和線粒體產(chǎn)生三磷酸腺苷 (ATP) 的速率進行同步定量，為研究細胞生物能量代謝提供了重要視角。將安捷倫 Seahorse XF 實時 ATP 速率測定試劑盒與最新的數(shù)據(jù)分析軟件相結合，應用新型工作流程對調(diào)節(jié)癌細胞代謝的藥劑進行快速功能篩選。本應用簡報介紹了 XF 實時 ATP 速率測定數(shù)據(jù)在選擇代謝調(diào)節(jié)劑和評估藥物效力方面所提供的豐富的信息。還展示了使用激酶抑制劑庫進行抗癌藥物篩選的工作流程。該工作流程可用于鑒別靶向癌細胞代謝的藥物化合物或影響線粒體和糖酵解代謝的藥物靶標。
 
 
前言
癌細胞在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中會經(jīng)歷代謝重編程。針對癌細胞代謝特性尋找治療靶標方面已經(jīng)取得了重大進展^[1]。此外，更好地了解癌細胞代謝可以提供有關惡劣腫瘤微環(huán)境的寶貴信息，從而可大幅改善實體瘤新興免疫療法的療效^[2,3]。對于省時且穩(wěn)定的分析工具的需求也在不斷增長，以探索調(diào)節(jié)癌細胞代謝的藥物靶標和基因。
 
XF 實時 ATP 速率測定能夠同時定量糖酵解和線粒體呼吸 ATP 產(chǎn)生速率。它使用 ATP 產(chǎn)生速率作為定量生物能量代謝活動的通用單位，對細胞能量表型進行定量表征。該測定旨在通過連續(xù)進樣寡霉素以及魚藤酮與抗霉素 A 的混合物來測量細胞的實時耗氧率和質(zhì)子釋放率。它能夠計算多個細胞生物能量代謝參數(shù)，包括來自單個樣品和測定的 (1) 線粒體 ATP 產(chǎn)生速率（mitoATP 速率）、(2) 糖酵解 ATP 產(chǎn)生速率（glycoATP 速率）、(3) 總 ATP 產(chǎn)生速率（總 ATP 速率）和 (4) XF ATP 速率指數(shù)^[4]。
 
XF 實時 ATP 速率測定是篩選和考察調(diào)節(jié)細胞生物能量代謝的候選物的強大工具，作為一種起始測定方法，它具有多項優(yōu)勢。首先，該測定提供了一種靈敏且直接的方法來檢測基礎代謝表型的變化。由于該測定同時測量兩條主要生物能量代謝通路的ATP 產(chǎn)生，因此能夠實時快速鑒別線粒體呼吸與糖酵解之間碳源使用的切換。此外，通過利用兩種代謝活動的 ATP 產(chǎn)生速率的通用單位，可以通過兩個參數(shù)之間的占比（糖酵解百分比 vs. 氧化磷酸化百分比）或比率（ATP 速率指數(shù)）來定量評估代謝變化。

其次，這種實時分析能夠鑒別細胞代謝表型的動態(tài)變化，而通過廣泛使用的熒光或發(fā)光探針測量細胞內(nèi) ATP 濃度則無法檢測到這些變化。在活細胞中，通過調(diào)整 ATP 產(chǎn)生和消耗的速率，細胞內(nèi) ATP 濃度受到嚴格調(diào)節(jié)并維持在穩(wěn)態(tài)水平。換句話說，細胞通過響應執(zhí)行任何細胞功能所需的 ATP 消耗的變化來增加或減少 ATP 的產(chǎn)生，反之亦然。由于細胞 ATP 水平的顯著改變表明發(fā)生了災難性事件，因此它們僅適用于評估細胞活力^[5,6]。相比之下，使用 XF 實時 ATP 速率測定來實時測量ATP 產(chǎn)生速率能夠測量總細胞能量生成代謝的變化。這些變化可用于評估細胞功能（例如活化、分化等），以及區(qū)分對個體生物能量代謝通路的影響，盡管其對細胞活力沒有顯著影響。第三，由于它測量基礎代謝率，因此該測定僅需先后進樣兩次試劑，且試劑具有寬最佳濃度范圍。無需額外的試劑優(yōu)化步驟。這一優(yōu)勢簡化了測定工作流程，特別是在篩選包含基因修飾的多個細胞系或細胞中的線粒體功能障礙時。最后，可用于該測定的定制軟件工具能夠快速定量測量由化學刺激或基因修飾引起的代謝干擾，包括篩選和劑量反應分析功能。
 
 
實驗部分
XF 實時 ATP 速率測定
ATP 產(chǎn)生速率按照《XF 實時 ATP 速率測定用戶指南》^[7]中所述進行測量。
 
將 A549 (ATCC) 和 PC-9 (ECACC) 細胞在補充有 2 mmol/L GlutaMax (Gibco) 和 10% 胎牛血清 (FBS, HyClone) 的 RPMI 1640 (Gibco) 中培養(yǎng)。將細胞以 1 × 10⁴ 個細胞/孔的密度接種到安捷倫 Seahorse XF Pro M 細胞培養(yǎng)微孔板中，并培養(yǎng)過夜。測定當天，將培養(yǎng)基更換為補充有 10 mmol/L 葡萄糖、1 mmol/L 丙酮酸鈉和 2 mmol/L 谷氨酰胺的 Seahorse XF RPMI 培養(yǎng)基 (pH 7.4)，在 37 °C 和不含 CO₂ 的條件下，將細胞分別在添加或不添加 1 µmol/L CB-839 或 BAY-876 的情況下孵育1 小時。測定結束后，使用 BioTek Cytation 1 細胞成像多功能微孔板檢測系統(tǒng)和安捷倫 Seahorse XF 成像和歸一化系統(tǒng)對細胞計數(shù)以實現(xiàn)數(shù)據(jù)歸一化。所有關鍵參數(shù)和圖表均使用Seahorse Analytics 生成。
 
表 1 列出了運行 XF 實時 ATP 速率測定以進行篩選和劑量反應研究所需的安捷倫產(chǎn)品。有關所有培養(yǎng)基類型的完整列表以及我們針對每種檢測試劑盒的建議，請參閱《安捷倫 Seahorse XF 培養(yǎng)基選擇指南》^[8]。
  
激酶抑制劑庫篩選
將 THP-1 和 PBMC 細胞分別在補充有 10% FBS 和 β-巰基乙醇的 RPMI 1640（貨號 A1049101，Gibco）和 Immunocult-XF T 細胞擴增培養(yǎng)基（貨號 10981，STEMCELL Technologies）中培養(yǎng)。將細胞重懸于補充有 10 mmol/L 葡萄糖、1 mmol/L 丙酮酸鈉和 2 mmol/L 谷氨酰胺的 XF RPMI pH 7.4 測定培養(yǎng)基（安捷倫）中，并以 2 × 10⁵ 個細胞/孔接種到安捷倫 Seahorse XFe96/XF Pro PDL 板上。每次測定前，將細胞在含有1 µmol/L 或 10 µmol/L 的 80 種不同激酶抑制劑（SCREEN-WELL 激酶抑制劑庫，貨號 BML-2832，Enzo Life Sciences）的條件下孵育 1 小時，而溶劑對照組在含有 0.1% DMSO 的條件下孵育。
 
表 1. 用于篩選和劑量反應分析的 XF 實時 ATP 速率測定所需的關鍵產(chǎn)品 * 貨號 103775-100 和 103777-100 包含安捷倫 Seahorse XF 探針板和 XF Pro M 細胞培養(yǎng)板 
** 貨號 103774-100 不包含進行 XF 測定所需的 XF 探針板。只有當需要其他孔板來優(yōu)化接種密度時才需要這個貨號的產(chǎn)品 
† 貨號 103799-100 不包含 XF 探針板。僅當存在非貼壁血癌細胞或免疫細胞時才需要此貨號
 
使用安捷倫 Bravo 液體處理器進行自動化測定設置
利用安捷倫 Bravo 液體處理器簡化測定前處理。在所有測定中使用 Bravo 進行細胞清洗，每孔留 100 µL 的最終體積，為添加 100 µL 的 2x 預處理溶液做準備。對于庫篩選，利用 Bravo 制備化合物，并在洗板后將化合物轉移到細胞板中。在此過程中使用的實驗耗材如《Bravo Seahorse 實驗工作臺用戶指南》所述^[9]。細胞清洗方案采用對《用于 Seahorse XFe96 樣品前處理的 Bravo 工作流程》^[10] 中的方案進行修改后的方案。在 96 孔儲液槽中進行連續(xù)稀釋和化合物庫稀釋，僅需一步即可轉移預處理溶液。加藥口采用手動加藥。如有需要，也可以使用 Bravo 完成此步驟。
 
CellTiter-Glo 測定
為測量總 ATP 水平，將 A549 或 PC-9 細胞以 2 × 10⁴ 個細胞接種到傳統(tǒng)白色 96 孔板 (Greiner) 中。暴露于代謝調(diào)節(jié)劑 1 小時后，根據(jù)制造商提供的手冊，使用 CellTiter-Glo (Promega) 試劑盒測量總 ATP 水平。

 
 
結果與討論
生物能量代謝表型變化的實時定量
如上所述，細胞內(nèi) ATP 水平或含量的測量常用于評估細胞活力。相比之下，在非致死或亞致死條件下，XF 實時 ATP 速率測定可提供比 ATP 的靜態(tài)量更多的有關細胞代謝表型的信息。為證明該方法檢測不影響細胞內(nèi) ATP 水平的代謝變化的靈敏度，對兩種非小細胞肺癌細胞系 A549 和 PC-9 在以下兩種代謝抑制劑中暴露 1 小時所獲得的結果進行了比較：CB-839，一種谷氨酰胺合酶抑制劑 (Selleck Chemicals)；和 BAY-876，一種 Glut1 葡萄糖轉運蛋白抑制劑 (Selleck Chemicals)。
 
圖 1A 顯示出在所示處理后測得的細胞內(nèi) ATP 水平的變化，表明在處理期間，無任何抑制劑導致測試的任一細胞系的細胞活力發(fā)生顯著變化。當測量總 ATP 產(chǎn)生速率時，觀察到類似的結果，在細胞暴露于 CB-839 后，僅觀察到 ATP 產(chǎn)生速率發(fā)生小幅下降（圖 1B）。相比之下，當單獨分析線粒體呼吸和糖酵解 ATP 產(chǎn)生速率時，在暴露于 CB-839 和 BAY-876 后分別觀察到顯著下降，因為相互代謝通路上調(diào)以補償抑制作用（圖 1C 和 1D）。因此，在這兩種細胞系中，用代謝抑制劑進行處理導致細胞代謝表型發(fā)生了劇烈變化。CB-839 將細胞轉變?yōu)楦�偏向糖酵解的表型，�?BAY-876 則將細胞轉變?yōu)楦�偏向有氧的表型（圖 1E），而總產(chǎn)生速率幾乎保持不變（圖 1B）。
 

圖 1. 使用 XF 實時 ATP 速率測定檢測線粒體和糖酵解調(diào)節(jié)劑。將 A549 和 PC-9 細胞用溶劑對照 (0.1% DMSO)、1 µmol/L CB-839 或 1 µmol/L BAY-876 預處理 1 小時，并分析靜態(tài)細胞內(nèi) ATP 水平 (A) 和 ATP 產(chǎn)生速率（B 至 E）。(A) 利用 CellTiter-Glo 測得的細胞內(nèi) ATP 濃度。(B) 總 ATP 產(chǎn)生速率。(C) 線粒體 ATP 產(chǎn)生速率。(D) 糖酵解 ATP 產(chǎn)生速率。(E) ATP 速率指數(shù)。（n = 6，平均值 ± SD）
 
此外，除監(jiān)測抑制劑所引起的代謝表型轉變以外，還可以定量比較通路特異性 ATP 產(chǎn)生速率的變化，并用于評價細胞對不同藥物的敏感性。由 CB-839 導致的 A549 的 mitoATP 產(chǎn)生速率和 ATP 速率指數(shù)的降低比 PC-9 的降低程度更大（圖 1C 和1E）。相比之下，與 A549 相比，響應 BAY-876 時 PC-9 細胞的 glycoATP 產(chǎn)生速率降低更多，并且 ATP 速率指數(shù)變化更顯著（圖 1D 和 1E）。
 
通過執(zhí)行劑量反應測定，能夠更清晰地評價這些敏感性差異（圖 2）。響應 CB-839 處理時的 mitoATP 速率變化的劑量反應研究顯示，A549 中的 IC₅₀ 為 PC-9 中的 1/50 以下（圖 2A）。相比之下，與 PC-9 相比，A549 中 BAY-876 的glycoATP 速率的 IC₅₀ 高出八倍多（圖 2B）。
 
抗癌代謝調(diào)節(jié)劑篩選
作為一種簡單而穩(wěn)定的代謝表型測定，XF 實時 ATP 速率測定非常適合篩選和評價代謝靶標候選藥物的藥物效力。例如，我們使用激酶抑制劑庫來篩選癌細胞特異性線粒體調(diào)節(jié)劑。其工作流程如圖 3 所示。簡而言之，評價了來自 SCREEN-WELL 激酶抑制劑庫 (Enzo Life Sciences) 的 80 種激酶抑制劑對THP-1 細胞（一種急性單核細胞白血病細胞系）和外周血單核細胞 (PBMC)（一種非癌細胞對照組）的代謝干擾。比較了它們與選定的表現(xiàn)出顯著獨特效果的抑制劑對細胞能量代謝的抑制作用。使用 Project 工具組合來自三個獨立篩選重復測定的數(shù)據(jù)，該工具是 Seahorse Analytics 軟件中的一種多文件分析功能，有助于鑒別在 THP-1 和 PBMC 中表現(xiàn)出不同反應的候選藥物。此外，通過比較兩種細胞類型的劑量反應，進一步評價了選定化合物的效力。
 
所有數(shù)據(jù)分析均采用 Seahorse Analytics 軟件，該軟件提供ATP 的產(chǎn)生速率工作流程簡化了早期藥物發(fā)現(xiàn)中篩選化合物和劑量反應實驗的數(shù)據(jù)解析。
 

圖 2. A549 與 PC-9 細胞系之間對代謝抑制劑敏感性的比較。如圖所示，在 Agilent XF 實時 ATP 速率測定之前，將 A549 和 PC-9 細胞用 CB-839 或BAY-876 預處理 1 小時。利用安捷倫 Seahorse Analytics 中的 XF ATP 速率劑量分析工具對 IC50 值進行評估。(A) mitoATP 速率對 CB-839 的劑量反應。(B) glycoATP 速率對 BAY-876 的劑量反應。(n = 4，平均值 ± SD）

圖 3. 提出的篩選靶向細胞代謝的抗癌藥物的工作流程。通過多個針對每種細胞類型的獨立的 XF 實時 ATP 速率測定來評價化合物對實驗細胞 (THP-1) 和對照細胞(PBMC) 的影響。根據(jù)安捷倫 Seahorse Analytics 中的調(diào)節(jié)劑排名，對重復測定進行組合和比較。利用劑量反應研究進一步分析藥物效力，以選擇對 THP-1 靶細胞具有特異性的代謝調(diào)節(jié)劑 
  
 
藥物效力評價
 
圖 4 示出在 THP-1 細胞中獲得的三次重復篩選測定結果的代表性數(shù)據(jù)。每種化合物對 ATP 產(chǎn)生速率的上調(diào)和下調(diào)可以用各種圖形格式（包括條形圖和熱圖）表示，因此用戶可以快速鑒別最有效的代謝調(diào)節(jié)劑。此外，ATP 速率 指數(shù)（以mitoATP 產(chǎn)生速率與 glycoATP 產(chǎn)生速率之間的比率計算）圖能夠檢測導致向線粒體呼吸（指數(shù)增加）或糖酵解表型（指數(shù)減�。┑娘@著代謝變化的藥物或狀況，可以顯示或導出為電子表格以供進一步分析。
 

圖 4. 篩選干擾癌細胞能量代謝的激酶抑制劑。在安捷倫 Seahorse XF 實時 ATP 速率測定之前，將 THP-1 細胞暴露于各種激酶抑制劑 (n = 80) 1 小時。(A) 比較對線粒體、糖酵解和總 ATP 產(chǎn)生速率的影響。(B) 使用 ATP 速率指數(shù)比較激酶抑制劑誘導的能量表型變化
  
此外，由重復測定得到的不同輸出參數(shù)的平均組合數(shù)據(jù)可以按升序或降序排序，從而允許根據(jù)測得的任何參數(shù)的影響對激酶抑制劑進行排序。如圖 5 所示，當獲得的 mitoATP 速率按降序排序時，一些激酶抑制劑顯著抑制 THP-1 細胞中的 mitoATP 產(chǎn)生速率（圖 5A），而較少數(shù)量的抑制劑看起來能夠有效抑制 PBMC 中的 mitoATP 速率（圖 5B）。通過比較對 mitoATP 產(chǎn)生速率和 ATP 速率指數(shù)的影響，選中幾種抑制劑。例如，SU1498 是對 THP-1 細胞的 mitoATP 產(chǎn)生具有最強抑制作用的化合物之一，而對 PBMC 幾乎沒有影響，對癌細胞類型表現(xiàn)出高特異性。U0126 對 mitoATP 速率表現(xiàn)出中度影響，但對 THP-1 細胞也具有高特異性。相比之下，AG-879 對于兩種細胞類型均有效，并且在 PBMC 中的作用略強。圖 5C 顯示出從 Seahorse Analytics 中排序的圖表導出的mitoATP 速率的數(shù)據(jù)表視圖。
 
已知 SU1498 能夠抑制 VEGFR2 受體和相關信號傳導并誘導線粒體功能障礙^[11,12]。MEK 抑制劑 U0126 被視為一種潛在的抗白血病藥劑，并且據(jù)報道能夠抑制線粒體功能并以不依賴于MEK 的方式誘導代謝表型轉變?yōu)橛醒跆墙徒?sup>[13,14]。據(jù)報道，ErbB2 激酶抑制劑 AG-879 可誘導癌細胞凋亡，但其對線粒體代謝的影響尚未得到充分研究。事實上，據(jù)報道，它在高濃度下能夠抑制 Glut1 活性^[15]。利用劑量反應研究，對這三種藥物的效力進行了評價（圖 6）。與預期一致，THP-1 與 PBMC 對 AG-879 的敏感性無顯著差異。相比之下，SU1398 和 U0126 僅在 THP-1 細胞中有效抑制線粒體呼吸。三種藥物都會誘導代謝變化，糖酵解活性相互增加，并且在短期孵育后對細胞活力無顯著影響。
 

圖 5. THP-1 選擇性抗線粒體化合物的鑒別。根據(jù)對 THP-1 (A) 和 PBMC (B) 的 mitoATP 速率的影響對抑制劑進行排名。在安捷倫 Seahorse Analytics 中，將每個排序的數(shù)據(jù)集導出到 Microsoft Excel 電子表格文件中，并且突出顯示了三種化合物 (C)。（n = 3，平均值 ± SEM）
 

圖 6. THP-1 和 PBMC 的 mitoATP 速率 (A) 和 glycoATP 速率 (B) 對三種選定激酶抑制劑的劑量反應。（n = 4，平均值 ± SD）
 
 
結論
安捷倫 XF 實時 ATP 速率測定是一種簡單而穩(wěn)定的檢測方法，能夠在癌癥藥物發(fā)現(xiàn)過程中鑒別相關代謝靶標通路。與專用分析軟件相結合，提供了一種直接的方法來定量和比較癌細胞由于化學品或基因修飾引起的代謝改變，并區(qū)分線粒體與糖酵解能量代謝。該測定適合作為篩選可誘導癌細胞代謝表型變化而對細胞活力無顯著影響的化合物的起始測定方法。此外，可以使用劑量反應測定來評價選定化合物的效力，或進行更全面的功能分析，以實現(xiàn)更詳細的臨床前研究。
 
 
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