案例詳讀：結(jié)腸炎通過(guò)抑制膽汁酸代謝改善膽汁淤積性肝病

原發(fā)性硬化性膽管炎（PSC）是最常見的慢性膽汁淤積性肝病之一；80%的PSC 患者同時(shí)患有炎癥性腸病(IBD)。PSC常常由于藥物療法收效甚微而發(fā)展為肝硬化，終末期的PSC患者唯一選項(xiàng)只有肝移植。既往的研究認(rèn)為IBD可能會(huì)促進(jìn)PSC的發(fā)生和發(fā)展。

2023年6月6日，德國(guó)亞琛工業(yè)大學(xué)附屬醫(yī)院的Christian Trautwein和Kai Markus Schneider相關(guān)團(tuán)隊(duì)在國(guó)際知名期刊Nature Communications上正式發(fā)表了題為“Colitis ameliorates cholestatic liver disease via suppression of bile acid synthesis”的研究性文章。研究團(tuán)隊(duì)認(rèn)為，PSC和IBD的同時(shí)發(fā)生表明腸肝器官存在互動(dòng)。他們首先發(fā)現(xiàn)PSC小鼠腸道菌群發(fā)生失調(diào)；使用IBD-PSC小鼠模型發(fā)現(xiàn)結(jié)腸炎可以減輕小鼠硬化性膽管炎的肝損傷和纖維化，涉及脂多糖 (LPS) 激活NF-κB、抑制體內(nèi)外膽汁酸（BA）代謝等相關(guān)通路。結(jié)合臨床結(jié)果表明當(dāng)肝臟疾病伴隨額外的腸道炎性疾病時(shí)，會(huì)更有利于膽汁淤積性肝臟疾病的預(yù)后。

1. 急性結(jié)腸炎改善Mdr2−/−小鼠肝細(xì)胞損傷和膽汁淤積

本研究選擇Mdr2敲除動(dòng)物進(jìn)行研究。Mdr2基因，也被稱為Abcb4，該基因編碼一種膜結(jié)合磷脂翻轉(zhuǎn)酶，幫助磷脂進(jìn)入膽汁。Mdr2的缺失會(huì)導(dǎo)致膽管內(nèi)磷脂濃度降低，缺少磷脂的膽汁成分可能會(huì)導(dǎo)致膽管受到損傷，膽石沉淀，誘發(fā)炎癥并進(jìn)一步導(dǎo)致肝癌的發(fā)生。Mdr2敲除小鼠在出生后2-3周，即可出現(xiàn)肝細(xì)胞損傷、血管擴(kuò)張及導(dǎo)管增生的表型，8-9周后，小鼠會(huì)出現(xiàn)肝纖維化癥狀，16個(gè)月后，大部分小鼠會(huì)發(fā)生肝癌病變。

本研究利用DSS（葡聚糖硫酸鈉鹽）處理WT和Mdr2−/−小鼠7天后引發(fā)急性結(jié)腸炎，表現(xiàn)為體重減輕、水樣或血性腹瀉、毛發(fā)豎立、運(yùn)動(dòng)和食欲下降以及結(jié)腸縮短；遠(yuǎn)端結(jié)腸觀察到最嚴(yán)重的病變。與對(duì)照組相比，DSS組結(jié)腸炎評(píng)分顯著升高，具有上皮屏障破壞、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和杯狀細(xì)胞丟失，隱窩變形，并伴有帶狀結(jié)構(gòu)等特征。有意思的是，與Mdr2−/−組動(dòng)物相比，Mdr2−/−+DSS組中肝細(xì)胞損傷標(biāo)志物（ALT、AST、GLDH）、膽汁淤積（AP）、caspase3活性顯著降低；相反地，NF-κB 調(diào)節(jié)的抗凋亡A1/Bfl-1和cIAP1明顯上調(diào)。肝臟組織學(xué)表明Mdr2−/−+DSS肝臟中的膽道纖維化、有絲分裂活性和膽管增殖保持不變。這些結(jié)果表明DSS誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎能改善Mdr2−/−小鼠的肝細(xì)胞損傷和膽汁淤積。

圖1. 急性結(jié)腸炎減輕Mdr2−/−小鼠膽汁淤積性肝細(xì)胞損傷

2. 結(jié)腸炎和腸道屏障損傷引發(fā)細(xì)菌成分易位和肝臟炎癥

免疫熒光染色、qPCR和WB證實(shí)DSS顯著降低了腸道緊密連接標(biāo)記物Mucin2 (MUC2)、ZO-1和 Occludin。體內(nèi)FITC-葡聚糖測(cè)定發(fā)現(xiàn)，DSS組的FITC-葡聚糖的易位顯著增加；此外，DSS組細(xì)菌 DNA含量增加——腸道屏障損傷致細(xì)菌成分易位增加。組織病理學(xué)檢查顯示Mdr2−/− + DSS 肝臟匯管區(qū)中性粒細(xì)胞增多；與免疫熒光染色一致：肝臟 Ly6G+和CD11b+細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著增加。熒光激活細(xì)胞分選（FACS）證明了Mdr2−/− +DSS小鼠肝臟中性粒細(xì)胞積累。Mdr2−/− +DSS小鼠在蛋白水平表現(xiàn)出IL1β、cleaved caspase1和NLRP3高表達(dá)，在mRNA水平表現(xiàn)出Il1β、F4/80、Nos2等基因的過(guò)表達(dá)。

圖2. 結(jié)腸炎和腸道屏障損傷引發(fā)細(xì)菌成分易位和肝臟炎癥

3. 結(jié)腸炎抑制Mdr2−/−小鼠膽汁酸的合成和運(yùn)輸

肝臟RNA測(cè)序結(jié)果顯示， Mdr2−/−組與Mdr2−/− +DSS組間有近400個(gè)顯著差異的基因�；�因集富集分析（GSEA）顯示Mdr2−/−+DSS組的細(xì)胞色素P450抑制膽汁分泌、膽固醇代謝、藥物或異生物質(zhì)代謝途徑；實(shí)時(shí)PCR證實(shí)了肝臟Cyp7a1和Cyp27a1在Mdr2−/−+DSS組顯著減少；Cyp7A1蛋白表達(dá)強(qiáng)烈減少。質(zhì)譜成像（MALDI-MSI）顯示，肝臟�；悄懰幔═CA）在Mdr2−/−顯著增加， DSS處理后明顯減少；而WT小鼠沒(méi)有顯著改變。上述結(jié)果通過(guò)HPLC-MS/MS測(cè)量血清中膽汁酸進(jìn)行確證，小鼠靜脈血、門靜脈血、肝臟和盲腸糞便中的總膽汁酸顯著降低，膽汁酸中間體7α-羥基-4-膽汁烯-3-酮（C4）的濃度也顯著降低。這些結(jié)果表明，DSS 引發(fā)的急性結(jié)腸炎導(dǎo)致BA合成、攝取和分泌的肝臟轉(zhuǎn)錄程序受到顯著抑制，從而引發(fā)全身BA水平降低。

圖3. 結(jié)腸炎抑制Mdr2−/−小鼠的膽汁酸合成和轉(zhuǎn)運(yùn)

4. DSS觸發(fā)肝臟炎癥介導(dǎo)BA代謝

與炎癥途徑相關(guān)的基因、基因集（上皮細(xì)胞的細(xì)菌侵襲、Toll樣受體信號(hào)傳導(dǎo)、趨化因子信號(hào)傳導(dǎo)等途徑）在Mdr2−/−+DSS肝臟中顯著上調(diào)。脾臟與體重比增加，表明Mdr2−/−+DSS組動(dòng)物全身免疫激活和腸道毒素易位。Spearman相關(guān)性揭示了炎癥基因（Tnf、Il1β、Nlrp3、Tlrs）與BA代謝相關(guān)基因（Cyp7a1、Cyp8b1、Cyp27a1、Cyp7b1、Fxr2、Ntcp、Oatp2、Bsep、Mrp2）之間存在負(fù)相關(guān)。并在已發(fā)表的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中觀察到的類似情況，LPS 刺激導(dǎo)致體外系統(tǒng)中膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)和合成基因劇烈下調(diào)。

LPS注射同樣表現(xiàn)出結(jié)腸炎樣癥狀。Mdr2-/-+LPS 小鼠表現(xiàn)出膽汁淤積性肝細(xì)胞損傷的緩解，伴隨血清 AST、ALT 和AP水平顯著降低；免疫組化表明 caspase 3主要在小鼠匯管區(qū)的免疫細(xì)胞中表達(dá)；抗凋亡A1/Bfl-1和cIAP1蛋白表達(dá)上調(diào)；共染色顯示TUNEL陽(yáng)性肝細(xì)胞較少。這些結(jié)果表明LPS注射會(huì)導(dǎo)致免疫細(xì)胞明顯凋亡，但不會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡。Mdr2-/-+LPS的肝臟中浸潤(rùn)性中性粒細(xì)胞數(shù)量顯著增加，磷酸化NF-κB P65的蛋白表達(dá)增加和肝細(xì)胞核易位，證明NF-κB激活以及炎癥基因（Nfκb、Tnfα、Il1β等）。與之前的DSS模型一致，關(guān)鍵基因Cyp7A1、Cyp8B1和Cyp27A1的mRNA水平、膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Ntcp、Oatp2、Bsep、Mrp2和Mrp3）也顯著減少。上述結(jié)果表明膽汁酸穩(wěn)態(tài)獨(dú)立于回腸或肝臟FXR信號(hào)傳導(dǎo)的反饋抑制，由DSS誘導(dǎo)的肝臟炎癥引起。

圖 4. DSS通過(guò)觸發(fā)肝臟炎癥介導(dǎo)BA代謝

5. NF-κB 信號(hào)傳導(dǎo)缺失加劇Mdr2−/−小鼠的膽汁淤積

相關(guān)性分析顯示NF-κB和BA代謝基因顯著負(fù)相關(guān)。使用Mdr2−/−NemoΔhepa小鼠模型，發(fā)現(xiàn)該小鼠生殖力低，年輕時(shí)有嚴(yán)重黃疸、體重減輕，甚至自發(fā)死亡，阻止了進(jìn)一步誘導(dǎo)結(jié)腸炎。即使在穩(wěn)態(tài)下，NF-κB 缺乏也會(huì)加劇膽汁淤積性肝損傷。流式細(xì)胞術(shù)顯示Mdr2−/−NemoΔhepa肝臟中嗜中性粒細(xì)胞積累；H&E、CK19 和天狼星紅染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明廣泛的膽管增殖和纖維化惡化。Mdr2−/−NemoΔhepa小鼠中Cyp7A1蛋白顯著上調(diào)，NEMO缺失導(dǎo)致肝臟總BA、血清中未結(jié)合BA的水平增加。這些發(fā)現(xiàn)表明肝細(xì)胞 NF-κB限制了Mdr2−/−小鼠的膽汁淤積，并作為結(jié)腸炎產(chǎn)生保護(hù)作用的中間介質(zhì)。

圖5. NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)缺失加劇Mdr2−/−小鼠的膽汁淤積

6. 慢性結(jié)腸炎減輕Mdr2−/−小鼠肝病進(jìn)展

長(zhǎng)期低劑量的DSS喂養(yǎng)，導(dǎo)致Mdr2−/−小鼠表現(xiàn)出結(jié)腸炎癥狀，伴有腹瀉、結(jié)腸發(fā)炎、結(jié)腸長(zhǎng)度縮短以及較高的脾臟與體重比；血清生化參數(shù)（ALT、AST、AP和GLDH）、caspase3顯著降低，抗凋亡蛋白（A1/Bfl-1和cIAP1）上調(diào)。小鼠膽管間隔纖維化得到改善，并通過(guò)天狼星紅和膠原蛋白I染色的定量證明。與之一致的是，Mdr2−/−+DSS小鼠中纖維化標(biāo)記物（ Col1a1、Col1a2、Col3a1）和活化的HSC標(biāo)記物（Timp1）的表達(dá)顯著降低。此外，肝臟炎癥基因（Icam-1、F4/80、Tlr4、Il1β、Nlrp3、Nfkb、Ccl5、Ifng、Il12a、Il10 ）的表達(dá)顯著增加，伴隨著磷酸化 NF-κB P65 蛋白水平升高和肝細(xì)胞核易位。與膽汁酸合成和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因（Cyp7a1、Cyp27a1）的mRNA水平、Oatp2、Mrp2）劇烈減少，肝臟 FXR 信號(hào)傳導(dǎo)（Fxr、Shp）不受影響。這些研究結(jié)果表明，慢性結(jié)腸炎引發(fā)的肝臟炎癥通過(guò)抑制膽汁酸合成來(lái)減少膽汁淤積性肝損傷和膽間隔纖維化。

圖6. 慢性結(jié)腸炎可減輕Mdr2−/−小鼠的肝臟疾病進(jìn)程

7. 臨床腸道炎癥與PSC患者較長(zhǎng)的無(wú)肝移植生存期相關(guān)

研究團(tuán)隊(duì)納入70例臨床患者，發(fā)現(xiàn)任何節(jié)段腸道（回腸末端、升結(jié)腸、降結(jié)腸或乙狀結(jié)腸）組織學(xué)炎癥的存在與肝移植或死亡風(fēng)險(xiǎn)降低存在相關(guān)。Kaplan-Meier分析表明組織學(xué)炎癥的嚴(yán)重程度（分級(jí)為無(wú)炎癥、輕度炎癥、中度和重度炎癥）與生存估計(jì)相關(guān)，無(wú)炎癥組的預(yù)后結(jié)果更差。

圖7. 腸道組織學(xué)炎癥可改善PSC患者的無(wú)肝移植生存期

8. 小結(jié)

一直以來(lái)結(jié)腸炎和屏障功能障礙被證明不利于肝臟和其他器官系統(tǒng)的多種疾病。然而，本研究的IBD-PSC小鼠模型揭示了結(jié)腸炎對(duì)Mdr2−/−小鼠肝損傷的保護(hù)作用。綜合運(yùn)用了多種組學(xué)技術(shù)（轉(zhuǎn)錄組、靶向/空間代謝組、16S rDNA微生物多樣性）和傳統(tǒng)分子生物學(xué)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸炎引發(fā)細(xì)菌成分易位和肝臟炎癥，導(dǎo)致膽汁酸合成和運(yùn)輸受阻；深入研究發(fā)現(xiàn)NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)缺失加劇膽汁淤積。而慢性結(jié)腸炎引發(fā)的肝臟炎癥可以通過(guò)抑制膽汁酸合成來(lái)減少膽汁淤積性肝損傷和膽間隔纖維化；并通過(guò)臨床案例證實(shí)實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果。本研究表明的腸道屏障炎癥損傷具有肝臟保護(hù)作用，為長(zhǎng)期存在的IBD-PSC關(guān)聯(lián)提供了新的視角，并為PSC多器官治療策略的臨床研究提供了強(qiáng)有力的實(shí)證依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

Colitis ameliorates cholestatic liver disease via suppression of bile acid synthesis. Nature Communications. 2023.

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繪譜幫你測(cè)

本研究通過(guò)多組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)調(diào)控膽汁酸可改善膽汁淤積性肝病。膽汁酸作為一類具有特殊生理作用的小分子，近年來(lái)被證實(shí)在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。在本研究中，利用膽汁酸分析發(fā)現(xiàn)結(jié)腸炎抑制了膽汁酸中間體C4的產(chǎn)量，是膽汁酸的合成和運(yùn)輸受阻的重要信號(hào)。在確認(rèn)回腸或肝臟FXR信號(hào)傳導(dǎo)沒(méi)有顯著差異后，本研究以炎癥為切入點(diǎn)深入挖掘其相關(guān)機(jī)制。針對(duì)膽汁酸譜，麥特繪譜擁有兩套絕對(duì)定量檢測(cè)方案：膽汁酸基礎(chǔ)版和膽汁酸旗艦版，支持膽汁酸與菌群聯(lián)合分析。

此外，以全定量靶向代謝組學(xué)技術(shù)為核心，以代謝組學(xué)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)疾病研究領(lǐng)域?yàn)榉较颍�麥特繪譜深耕多年累積了全球獨(dú)有技術(shù)Q1000、Q300、Q200和各類小分子代謝物單獨(dú)檢測(cè)方法共20多套；同時(shí)，麥特繪譜還有菌群16S測(cè)序、宏基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等多組學(xué)，及聯(lián)合分析在內(nèi)的全套解決方案。優(yōu)選的檢測(cè)技術(shù)、全面的數(shù)據(jù)報(bào)告及專業(yè)的售后探討，助您科研探索之路不斷創(chuàng)新和突破。詳情請(qǐng)咨詢繪譜熱線400-867-2686，獲取詳細(xì)資料！

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