內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激-ATF-6激活在循環(huán)拉伸誘導的成肌細胞自噬和凋亡中的作用

安氏Ⅱ類錯牙合是口腔正畸學中的一種臨床疾病。功能矯治器是一種本身不產(chǎn)生任何機械力，通過改變頜面部的肌肉環(huán)境，促進頜發(fā)育及顱面骨骼生長的一類矯正器。機械力信號被傳遞到細胞中并促進骨骼肌重塑。因此，闡明拉伸誘導的細胞凋亡的潛在機制對于進一步優(yōu)化臨床治療非常重要。

細胞凋亡的機制是多種多樣的，其中比較常見的有三種機制，分別為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（ERS）、線粒體通路和死受體通路。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)折疊和修飾是一個高度調(diào)控的過程。然而，各種內(nèi)源性和外源性應激可以破壞細胞器中的蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)，導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。越來越多的證據(jù)表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激也會導致自噬。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，有助于自噬發(fā)生的IRE1-JNK、PERK-eIF2α和AKT-TSC-mTOR信號通路在ERS條件下被激活。

未折疊蛋白反應（UPR）是一種高度保守的適應性機制，有三個分支協(xié)調(diào)對未折疊或錯誤折疊蛋白質(zhì)的有害累積的反應。它們包括：肌醇需求酶1α（IRE1α）、蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）和激活轉(zhuǎn)錄因子6（AFT6）。CHOP，Caspase-12和JNK是三個與ER相關的信號通路。研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在骨骼肌重塑中拉伸誘導的細胞凋亡中起著至關重要的作用。激活的ATF-6進入細胞核以促進UPR相關蛋白的表達。這增加了ER的生物合成能力，從而使細胞在ERS下存活。當ERS被觸發(fā)和延長時，ATF-6還可以激活CHOP等下游蛋白，從而誘導細胞凋亡。然而，ATF-6信號通路在骨骼肌重塑中的作用尚不清楚。

Bcl-2家族蛋白對于調(diào)節(jié)各種細胞的凋亡至關重要。據(jù)報道，Bcl-2通過與Beclin1相互作用來調(diào)節(jié)自噬，Beclin1被稱為自噬的標記蛋白。Bcl-2 對自噬和凋亡的信號通路存在交叉調(diào)控。然而，目前尚不清楚ATF-6通路是否參與拉伸誘導的成肌細胞的凋亡和自噬。

為了解決這個問題，青島大學附屬醫(yī)院口腔正畸科、青島市立醫(yī)院口腔科的研究團隊曾研究了拉伸誘導的成肌細胞凋亡和自噬的潛在分子機制，這有助于闡明機械拉伸產(chǎn)生的ERS條件下自噬與細胞凋亡之間的關系。相關內(nèi)容發(fā)表在 Apoptosis 期刊題為“Dual role of endoplasmic reticulum stress-ATF-6 activation in autophagy and apoptosis induced by cyclic stretch in myoblast”。
 
首先，為了確認機械拉伸對細胞活力的影響，將成肌細胞暴露于15% 伸長率的循環(huán)機械拉伸下（每循環(huán)提供6 秒的機械拉伸）分別持續(xù)0、6、12和24小時，結果表明，機械拉伸顯著降低了細胞活力，呈時間依賴性抑制了成肌細胞的生長。接著采用TUNEL染色和AV/PI流式細胞術分析了機械拉伸的促凋亡作用，數(shù)據(jù)表明，成肌細胞的凋亡率隨著負荷時間逐漸升高，并在24 小時時達到最大值�；�于這些結果，得出結論，機械拉伸誘導成肌細胞凋亡是時間依賴性的。

為探究ERS對拉伸誘導的成肌細胞凋亡的作用，采用qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測ERS標志基因（GRP78、ATF-6、CHOP和Caspase-12）的表達。結果表明，ERS相關基因的mRNA水平隨著拉伸時間的增加而上調(diào)，并在24小時時達到峰值（圖1 A）。用機械拉伸處理24 小時后，ER相關基因蛋白的表達水平與mRNA表達呈相似升高（圖1 B）。這說明，循環(huán)拉伸激活ERS介導的細胞凋亡。 圖1    循環(huán)拉伸激活ERS介導的細胞凋亡。（A）通過實時PCR檢測GRP78，ATF-6，CHOP和Caspase-12的表達。（B）具有代表性的蛋白質(zhì)印跡結果顯示拉伸對GRP78，ATF-6，CHOP和Caspase-12 蛋白質(zhì)水平的影響。

接下來，為了闡明自噬在機械應力下牙頜面肌肉重塑中的作用，實驗使用蛋白質(zhì)印跡檢測自噬相關蛋白（LC3-II、p62、Beclin1）的表達。結果表明，Beclin1和LC3-II在拉伸組中的表達呈時間依賴性顯著升高，而p62隨著拉伸時間的延長而降低。而且循環(huán)拉伸24 小時后，成肌細胞中雙膜自噬體的數(shù)量增加。LC3-II積累表明自噬體形成增加或自噬體-溶酶體融合受損。這些結果表明，機械拉伸處理后成肌細胞發(fā)生細胞自噬。

為了進一步證實ERS在拉伸誘導的細胞凋亡和自噬中的作用，在成肌細胞中使用ERSS抑制劑4-PBA。ERS被4-PBA預處理抑制（圖2 A）。4-PBA成功降低了Beclin1的蛋白質(zhì)水平，拉伸誘導的成肌細胞中的LC3II降低，但沒有降低p62（圖2 A）。如圖2 B所顯示，抑制ERS緩解拉伸誘導的成肌細胞凋亡。此外，循環(huán)拉伸增加了紅色和黃色點狀體的百分比，而4-PBA處理抑制了此效果。這表明4-PBA處理顯著緩解了拉伸誘導的自噬（圖2 C）。這些結果表明，ERS參與拉伸誘導的細胞凋亡和自噬。
最后，為了進一步闡明自噬的作用及其與ERS和細胞凋亡的關系，使用3-MA抑制成肌細胞的自噬。與單獨機械拉伸組相比，3-MA和機械拉伸的聯(lián)合處理顯著增強了CHOP的表達。同時，3-MA處理也增加了凋亡細胞的數(shù)量。然而，3-MA對ERS標志物（GRP78和ATF-6）沒有明顯影響。此外，3-MA顯著增加了拉伸誘導的成肌細胞凋亡。這些結果表明，自噬參與拉伸誘導的成肌細胞凋亡，但可能對ERS沒有明顯影響。從圖2 A表明，4-PBA預處理顯著改善了成肌細胞中LC3II/I和細胞凋亡相關蛋白的表達。然而，抑制自噬對ERS相關蛋白GRP78和ATF-6的表達沒有明顯影響。這意味著，循環(huán)拉伸暴露下自噬不是ERS 的原因。

上述結果表明，ATF-6可能在拉伸誘導的自噬和細胞凋亡中起重要作用。因此，為進一步闡明其在機械拉伸誘導的成肌細胞凋亡和自噬中的作用，創(chuàng)建了ATF-6沉默的成肌細胞，在循環(huán)拉伸之前用ATF-6 siRNA3轉(zhuǎn)染成肌細胞（圖3 A）。數(shù)據(jù)顯示，機械拉伸對成肌細胞的凋亡作用減弱（圖3 C）。敲低ATF-6可以顯著降低CHOP的水平，增加Bcl-2的水平，cleaved Caspase-12 表達無變化。這意味著，ATF-6通過循環(huán)拉伸處理的成肌細胞中的Bcl-2和CHOP通路在ERS介導的細胞凋亡中發(fā)揮作用。這些結果表明，ATF-6通路在調(diào)節(jié)拉伸誘導的成肌細胞凋亡和自噬過程中起著至關重要的作用。 （A）蛋白質(zhì)印跡和實時PCR結果證實，在siRNA3轉(zhuǎn)染的成肌細胞中，ATF-6水平被敲低最多。（B）蛋白質(zhì)印跡結果表明，轉(zhuǎn)染siRNA或不轉(zhuǎn)染siRNA后，拉伸成肌細胞中CHOP、 Cleaved Caspase-12、Bcl-2、LC3、Beclin1和p62的表達水平（C）通過膜聯(lián)蛋白V-FITC染色檢測細胞凋亡。（D）用mRFP-GFP-LC3腺病毒轉(zhuǎn)染24小時，轉(zhuǎn)染siRNA或不轉(zhuǎn)染siRNA后，免疫熒光測定成肌細胞中的自噬。

綜上所述，這項研究表明，成肌細胞在體外經(jīng)歷循環(huán)拉伸，并通過凋亡和自噬方式對機械拉伸做出反應，這與ATF-6介導的ERS通路密切相關。在機械拉伸下，自噬被誘導。這削弱了成肌細胞凋亡的過程，這已被確定為防止細胞死亡的作用。該研究解釋了ATF-6通路在拉伸誘導的細胞凋亡和自噬的分子機制中的作用，確保了對功能性器具影響成肌細胞的機制有充分的了解。然而，在拉伸刺激下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導的成肌細胞凋亡和自噬之間發(fā)生的串擾需要進一步闡明。因此，未來的研究可以闡明ERS，細胞凋亡和自噬參與拉伸成肌細胞的確切相互作用機制。

參考文獻：Zhang Q, Liu G, Liu R, Liu J, Zeng X, Ren D, Yan X, Yuan X. Dual role of endoplasmic reticulum stress-ATF-6 activation in autophagy and apoptosis induced by cyclic stretch in myoblast. Apoptosis. 2023 Jun;28(5-6):796-809. doi: 10.1007/s10495-023-01825-5. Epub 2023 Mar 7. Erratum in: Apoptosis. 2023 Jul 13;: PMID: 36881290.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36881290/

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