衰老肌肉干細(xì)胞的生長速率降低與機(jī)械敏感性受損有關(guān)

肌肉減少癥是指隨著年齡增長而發(fā)生的肌肉質(zhì)量減少、骨骼肌流失和肌肉功能強(qiáng)度下降等，這是人體衰老的重要標(biāo)志。影響肌肉質(zhì)量和功能的原因有很多，但都是基于這兩個基礎(chǔ)機(jī)制：肌肉纖維萎縮和肌肉纖維丟失。這種肌肉纖維丟失歸因于老化肌肉和相關(guān)肌肉干細(xì)胞（MuSC）的再生能力受損。

已經(jīng)提出了幾種導(dǎo)致MuSC功能受損的機(jī)制，特別是MuSC生態(tài)位的改變和細(xì)胞內(nèi)在變化。其生態(tài)位中的MuSCs固定在宿主肌纖維的肌膜上，即在其基底側(cè)通過鈣粘蛋白，在其頂端側(cè)通過整合素、蛋白聚糖和肌營養(yǎng)不良蛋白聚糖固定在基底膜。在肌纖維拉伸-縮短后，由于細(xì)胞外基質(zhì)（ECM，即肌內(nèi)膜）的拉伸和剪切變形，MuSCs承受機(jī)械載荷。這些變形也會導(dǎo)致肌肉內(nèi)的間質(zhì)液運(yùn)動。目前尚不清楚MuSCs是否可以感知這些流體運(yùn)動。

YAP核易位和轉(zhuǎn)錄活性是否在衰老MuSCs中失調(diào)尚不清楚，但YAP核化/活性可能是MuSCs中機(jī)械傳感能力改變的指標(biāo)。衰老MuSCs的機(jī)械敏感性受損的后果可能是廣泛的，因?yàn)闄C(jī)械線索始終存在，無論它們來自肌肉活動還是生態(tài)位條件，并且對細(xì)胞功能具有最重要的影響。例如，細(xì)胞對基質(zhì)剛度的感應(yīng)會影響干細(xì)胞的粘附、形態(tài)、自我更新和命運(yùn)決定。在衰老的MuSCs中，粘附、形態(tài)、黏著斑、YAP核化/活性和增殖是否發(fā)生內(nèi)在改變尚未得到研究，但如果衰老的MuSCs的機(jī)械傳感能力惡化，這些參數(shù)也必然會受到影響。

去年，阿姆斯特丹牙科學(xué)術(shù)中心、比利時(shí)魯汶大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所、法國索邦大學(xué)等聯(lián)合團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)研究曾旨在闡明衰老的MuSCs在感知和響應(yīng)機(jī)械線索的能力方面是否受到內(nèi)在損害。相關(guān)研究成果發(fā)表在 Aging 題為“Reduced growth rate of aged muscle stem cells is associated with impaired mechanosensitivity”。 增殖減少可能是骨骼肌再生能力隨年齡增長而下降的限制因素。首先，研究發(fā)現(xiàn)盡管YAP核定位很高，但與年輕的MuSCs相比，衰老的MuSCs在體外的生長速率顯著降低。衰老與MuSCs基因表達(dá)譜的改變有關(guān)。升高的細(xì)胞周期抑制劑CDKN2A（P16）是衰老細(xì)胞中的細(xì)胞標(biāo)志物，其表達(dá)在衰老的MuSCs中被證明增加。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與年輕MuSCs相比，衰老的MuSCs表現(xiàn)出較低的Pax7、Ccnd1、Cdk4基因表達(dá)和較高的Myog表達(dá)，而Cdkn2a在衰老的MuSCs中的表達(dá)略高但并不顯著。此外，衰老的MuSCs中的IL-6基因表達(dá)較低，這表明衰老的MuSCs在控制增殖和MuSC功能的信號通路中發(fā)生了內(nèi)在改變。即目前的研究支持這樣一種觀點(diǎn)，除了細(xì)胞外因素外，MuSCs的一些內(nèi)在變化會導(dǎo)致MuSC生長速率降低和功能改變，接下來的研究將討論衰老的MuSCs的這些內(nèi)在變化。

細(xì)胞的物理性質(zhì)，包括面積、頂點(diǎn)高度、形狀、核體積和細(xì)胞體積均受到嚴(yán)格調(diào)控，并受到各種刺激的影響，例如底物剛度、滲透壓變化、剪切應(yīng)力等機(jī)械擾動和生化信號。這些細(xì)胞參數(shù)的變化會影響干細(xì)胞功能和命運(yùn)。因此，實(shí)驗(yàn)研究了衰老MuSCs的生長速率降低是否也伴隨著細(xì)胞形態(tài)特性的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖1），與年輕的MuSCs相比，衰老的MuSCs的細(xì)胞體積增加。細(xì)胞體積的增加對MuSCs的機(jī)械性能和機(jī)械敏感性有影響。此外，研究確定了衰老的MuSCs體積增加是否伴隨著粘附數(shù)的減少，結(jié)果表明，衰老的MuSCs體積的增加可能至少部分是焦點(diǎn)粘連（focal adhesion）的組裝和/或細(xì)胞骨架改變的結(jié)果。這可能會影響衰老的MuSCs生態(tài)位內(nèi)的機(jī)械性能和機(jī)械敏感性。 （A）培養(yǎng) 3 天的年輕和老化 MuSCs 的俯視圖（XY）和橫截面圖像（XZ，白色虛線），并染色 F-肌動蛋白絲（綠色）和細(xì)胞核（紅色）以量化細(xì)胞形態(tài)測量。（B、C）MuSCs在基質(zhì)膠涂層玻璃基板上的細(xì)胞擴(kuò)散面積和細(xì)胞頂點(diǎn)高度。（D、E）老化MuSCs表現(xiàn)出比年輕MuSC大18%的細(xì)胞體積，而核體積沒有差異。（F-H）年輕和老化MuSC之間的細(xì)胞形狀描述符沒有差異。（I-N）年輕和老化MuSCs的細(xì)胞頂點(diǎn)高度，細(xì)胞體積和細(xì)胞面積之間的相關(guān)性。

NO是一種重要的信號分子，通過激活基質(zhì)金屬蛋白酶并從ECM釋放肝細(xì)胞生長因子，參與肌肉再生過程中MuSCs的激活。先前已經(jīng)證明，脈動剪切應(yīng)力（PFSS）誘導(dǎo)的C2C12（小鼠成肌細(xì)胞）肌管中NO生成需要完整的糖萼，并且糖萼的去除會消除PFSS對NO產(chǎn)生的影響。研究發(fā)現(xiàn)，年輕和老化的MuSCs對PFSS的反應(yīng)相似，NO產(chǎn)生增強(qiáng)（圖2）。抑制NO是否會導(dǎo)致年輕和衰老的MuSCs活性的差異目前尚不清楚。

造血干細(xì)胞與其細(xì)胞生態(tài)位的粘附性降低會對干細(xì)胞數(shù)量和功能產(chǎn)生負(fù)面影響。在目前的研究中，與年輕的MuSCs相比，老化的MuSCs與基質(zhì)膠涂層玻璃基板的附著力較低，而由于PFSS應(yīng)用，大量MuSC脫附。衰老的MuSCs中焦點(diǎn)粘連減少和ITGA7表達(dá)降低可能解釋了細(xì)胞對基質(zhì)膠涂層玻璃基板的粘附減少。此外，衰老的MuSCs中Ptk2基因表達(dá)的降低與細(xì)胞粘附的減少一致。細(xì)胞-基質(zhì)粘附在多能干細(xì)胞的增殖和形態(tài)中起作用。實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)論是，衰老MuSCs的生長速率降低至少部分是由于細(xì)胞粘附減少。 圖2     PFSS誘導(dǎo)的NO產(chǎn)生和MuSC脫附。（A）PFSS誘導(dǎo)年輕和老化MuSC產(chǎn)生NO。PFSS效果顯著，與靜態(tài)對照差異顯著。（B）透明質(zhì)酸（糖萼成分，綠色）和細(xì)胞核（藍(lán)色）染色的MuSC。俯視圖（XY）和橫截面圖像（XZ，白色虛線）顯示年輕和老化MuSCs表達(dá)糖萼（白色箭頭）。（C）培養(yǎng)第一天和第三天年輕和老化MuSC中的糖萼表達(dá)。（D）PFSS處理前后MuSCs的顯微照片顯示老化MuSCs的數(shù)量下降。（E）在1小時(shí)PFSS期間（4.13 Pa/s），43%的老化MuSC從基質(zhì)膠涂層的載玻片上脫附。

整合素的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域與許多銜接蛋白（即PTK2和paxillin）相連，它們參與肌動蛋白細(xì)胞骨架組織、粘附、遷移、增殖、調(diào)節(jié)細(xì)胞形狀以及將生化和機(jī)械信號傳遞到細(xì)胞中。在目前的研究中顯示，衰老的MuSCs中Ptk2基因表達(dá)下降，pPXN簇?cái)?shù)量減少，這表明衰老的MuSCs的生長速率降低和機(jī)械敏感性喪失至少部分是由于黏著斑形成和/或周轉(zhuǎn)減少。此外發(fā)現(xiàn)，在衰老的MuSCs中，Itga7基因表達(dá)和ITGA7蛋白表達(dá)均降低，Itga5和Itgb5基因表達(dá)也下降。這表明ITGA7表達(dá)降低和黏著斑形成與隨著年齡增長而改變的MuSC功能有關(guān)，可能是由于生態(tài)位變化導(dǎo)致MuSCs的內(nèi)在變化。ITGA7和pPXN是改善衰老MuSC功能的潛在治療靶點(diǎn)。

在機(jī)械傳感中，hippo 通路及其效應(yīng)子YAP和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白1（TAZ）是轉(zhuǎn)錄輔助因子，通過穿梭到細(xì)胞核中并通過與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合誘導(dǎo)基因表達(dá)的上調(diào)而發(fā)揮重要作用。它們決定MuSC的命運(yùn)并影響肌肉再生。因此實(shí)驗(yàn)研究了在年輕和老化的靜態(tài)對照和PFSS處理的MuSCs中YAP核定位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，老化靜態(tài)對照和PFSS處理的MuSCs的總YAP比年輕MuSCs高5.3%，與靜態(tài)對照相比，PFSS處理的年輕的MuSC在YAP強(qiáng)度方面呈上升趨勢。此外，還確定了YAP核定位，老化MuSC表現(xiàn)出比年輕MuSC高59%的核YAP熒光強(qiáng)度。PFSS對MuSCs核內(nèi)的YAP含量沒有顯著變化，但在年輕的MuSCs中，PFSS處理后的YAP核化略有增加。間充質(zhì)干細(xì)胞中的YAP核化取決于細(xì)胞附著面積，與焦點(diǎn)粘連的組裝無關(guān)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，附著面積較小的年輕和老化MuSC都表現(xiàn)出更高的YAP核化。

最后，研究發(fā)現(xiàn)，受剪切力作用的年輕MuSC上調(diào)了參與調(diào)節(jié)粘附，細(xì)胞周期和MuSC功能的基因的表達(dá)（圖3）。老化的MuSCs對剪切力不太敏感，并且表現(xiàn)出較少的基因上調(diào)，這表明機(jī)械敏感性降低是由于整合素蛋白表達(dá)（即ITGA7，ITGA5和ITGB5）和焦點(diǎn)粘附數(shù)減少。此外，實(shí)驗(yàn)觀察到在相似、明確的培養(yǎng)條件下，年輕和衰老的MuSCs之間的機(jī)械反應(yīng)性存在差異。這表明，衰老的MuSCs在體外的機(jī)械反應(yīng)性降低可能是由于衰老相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)在改變。未來的研究應(yīng)致力于體內(nèi)驗(yàn)證。研究還發(fā)現(xiàn)，剪切力會導(dǎo)致年輕和老化的MuSC變形。有趣的是，老化的MuSCs在剪切力下仍然變形，而年輕的MuSCs恢復(fù)了其最初的細(xì)胞頂點(diǎn)高度。此外，衰老的MuSCs顯示出更高的細(xì)胞硬度變化，如力誘導(dǎo)的細(xì)胞壓痕所示，這表明衰老的MuSCs具有改變的細(xì)胞骨架。 圖3     老化MuSC對PFSS的機(jī)械敏感性減弱。（A）響應(yīng)PFSS的MuSC基因表達(dá)。（B）在流體剪切應(yīng)力處理之前（靜態(tài)）和期間染色的年輕和老化 MuSC 的共聚焦俯視圖 （XY） 和橫截面 （XZ） 活細(xì)胞圖像，用于 F-肌動蛋白絲（紅色）和細(xì)胞核（綠色），說明由于流體剪切應(yīng)力而導(dǎo)致細(xì)胞頂點(diǎn)高度的變化。（C、D）在CFSS處理開始時(shí)，CFSS誘導(dǎo)MuSC變形并降低年輕和老化MuSCs的細(xì)胞頂點(diǎn)高度。（E）年輕和老化的MuSCs具有相似的楊氏模量（~450Pa）。與年輕MuSC（27%）相比，老化MuSCs（61%）的變異系數(shù)較大。（F）力壓痕曲線顯示，與年輕的 MuSC 相比，壓痕老化 MuSC 所需的力變化很大。（G）納米壓痕之前和期間染色 F-肌動蛋白絲（紅色）和細(xì)胞核（綠色）的年輕 MuSC 的共聚焦橫截面顯微照片，說明細(xì)胞變形（虛線）。

在這項(xiàng)研究中，發(fā)現(xiàn)衰老的MuSCs的生長速率受到了內(nèi)在的損害。由于ITGA7表達(dá)降低和粘附形成減少，細(xì)胞外部環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)部之間的機(jī)械聯(lián)系受到年齡的顯著影響，這與細(xì)胞體積增加，MuSC粘附降低以及細(xì)胞對機(jī)械負(fù)荷的機(jī)械敏感性改變相吻合。此外，YAP信號在衰老的MuSCs中發(fā)生了改變，包括細(xì)胞周期基因在內(nèi)的幾個基因的表達(dá)降低。作為一種暗示，一種可能的治療選擇可能是恢復(fù)衰老的MuSCs中的ITGA7和粘附數(shù)，這可能有助于恢復(fù)MuSCs粘附到其生態(tài)位以及這些細(xì)胞的生長速度。

參考文獻(xiàn)：Haroon M, Boers HE, Bakker AD, Bloks NGC, Hoogaars WMH, Giordani L, Musters RJP, Deldicque L, Koppo K, Le Grand F, Klein-Nulend J, Jaspers RT. Reduced growth rate of aged muscle stem cells is associated with impaired mechanosensitivity. Aging (Albany NY). 2022 Jan 13;14(1):28-53. doi: 10.18632/aging.203830. Epub 2022 Jan 13. PMID: 35023852; PMCID: PMC8791224.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35023852/

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