NIR-II半導(dǎo)體聚合物點(diǎn)：鏈堆積調(diào)節(jié)和深部組織中的高對(duì)比度血管成像

研究?jī)?nèi)容：近紅外二區(qū)（NIR-II）窗口的熒光成像在研究血管結(jié)構(gòu)和血管生成方面引起了人們的極大興趣，為早期疾病的精確診斷提供了有價(jià)值的信息。然而，由于熒光團(tuán)的強(qiáng)光子散射和低熒光亮度，對(duì)深層組織中的小血管成像仍然具有挑戰(zhàn)性。本文描述了作者在熒光探針設(shè)計(jì)和圖像算法開發(fā)方面的共同努力。首先，使用聚合物共混策略來(lái)調(diào)節(jié)大型剛性NIR-II半導(dǎo)體聚合物的鏈堆積行為，以產(chǎn)生緊湊明亮的聚合物點(diǎn)（Pdots），這是小血管體內(nèi)熒光成像的先決條件。進(jìn)一步開發(fā)了一種穩(wěn)健的Hessian矩陣方法來(lái)增強(qiáng)血管結(jié)構(gòu)的圖像對(duì)比度，特別是小血管和弱熒光血管。與原始圖像相比，在全身小鼠成像中獲得的增強(qiáng)的血管圖像在信噪比（SBR）方面表現(xiàn)出超過(guò)一個(gè)數(shù)量級(jí)的改善。利用明亮的Pdots和Hessian矩陣方法，作者最終進(jìn)行了顱骨NIR-II熒光成像，并在攜帶腦腫瘤的小鼠和大鼠模型中獲得了高對(duì)比度的腦血管系統(tǒng)。Pdots探針開發(fā)和成像算法增強(qiáng)的研究為深層組織的NIR-II熒光血管成像提供了一種很有前景的方法。

 

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圖1.（a）NIR-II半導(dǎo)體聚合物的分子結(jié)構(gòu)。（b）由純NIR-II半導(dǎo)體聚合物制備的聚集體或線狀聚合物納米結(jié)構(gòu)的TEM圖像。（c）通過(guò)將短剛性半導(dǎo)體聚合物與NIR-II半導(dǎo)體聚合物共混得到小球形Pdots的TEM圖像。

 

首先，作者研究了由兩組氟取代的半導(dǎo)體聚合物制備的NIR-II Pdots的大小和形態(tài)，單純的NIR-II聚合物納米顆粒是通過(guò)再沉淀法制備的，透射電子顯微鏡(TEM)觀察納米粒子呈現(xiàn)大尺寸和線狀形態(tài)。通過(guò)混合NIR-II聚合物和CN-PPV獲得的Pdots的大小和形態(tài)發(fā)生了顯著變化。從TEM圖像可以看出，所有六種類型的混合Pdots均表現(xiàn)出小尺寸和球形形態(tài)，與純CN-PPV Pdots相似。CN- PPV聚合物在Pdots形成過(guò)程中具有協(xié)同效應(yīng)，迫使大的剛性聚合物主鏈折疊并扭曲NIR-II聚合物的鏈堆積，從而形成小尺寸的球形形態(tài)。這表明混合具有小共軛長(zhǎng)度的傳統(tǒng)半導(dǎo)體聚合物是制備小尺寸球形NIR-II Pdots的可靠策略。

 

實(shí)驗(yàn)證實(shí)，只有共軛聚合物，才能有效調(diào)節(jié)NIR-II半導(dǎo)體聚合物的鏈堆積行為，產(chǎn)生小球形的Pdots。作者研究了不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NIR-II聚合物m-PBTQ4F分別與PSMA、PS-PEG-COOH和CN-PPV共混制得的納米粒子的形態(tài)變化。對(duì)于PSMA和PS-PEG-COOH，所得到的大多數(shù)納米顆粒都呈短絲狀形態(tài)。雖然通過(guò)共混(1：1比例)可以減小粒子的尺寸，但粒子的尺寸分布很大，在透射電子顯微鏡中仍觀察到部分橢圓形的納米粒子。相反，當(dāng)m-PBTQ4F與CN-PPV混合時(shí)，隨著CN-PPV分?jǐn)?shù)的增加，觀察到了向單分散球形Pdots的明顯形態(tài)演變。這些結(jié)果表明，共混剛性共軛聚合物可以有效調(diào)節(jié)NIR-II半導(dǎo)體聚合物的鏈堆積，得到致密的球形Pdots，而柔性兩親聚合物沒有類似的效果。

圖3. (a)聚乙二醇化CN-PPV Pdots、m-PBTQ4F Pdots和 (b) 聚乙二醇化m-PBTQ4F/CN-PPV混合Pdots的吸收和發(fā)射光譜。(c)聚乙二醇化m-PBTQ4F/CN-PPV Pdots的流體動(dòng)力學(xué)直徑和TEM圖像。(d)在808 nm連續(xù)輻射下ICG和Pdots在相同質(zhì)量濃度的水中的光穩(wěn)定性。

 

為了使Pdots具有更長(zhǎng)的血液循環(huán)時(shí)間，將m-PBTQ4F和CN-PPV聚合物組成的小尺寸Pdots進(jìn)一步用兩親性PS-PEG-COOH官能化。觀察三種類型Pdots的吸收和發(fā)射光譜，發(fā)現(xiàn)混合Pdots的吸收光譜與純m-PBTQ4F和CN-PPV Pdots的吸收光譜一致。此外，混合的Pdots在可見光和NIR-II區(qū)域顯示出雙發(fā)射峰。動(dòng)態(tài)光散射(DLS)測(cè)量和TEM結(jié)果顯示，混合的Pdots呈球形，流體動(dòng)力學(xué)直徑約為20 nm。以臨床批準(zhǔn)的染料ICG為對(duì)照，對(duì)Pdots的光穩(wěn)定性進(jìn)行了表征，在808 nm激光持續(xù)照射2 h下，Pdots的熒光保持接近原始強(qiáng)度的88%，而ICG在10 min內(nèi)完全光漂白，表明Pdots具有優(yōu)異的光穩(wěn)定性。與不同濃度的Pdots孵育24小時(shí)后的細(xì)胞存活率測(cè)定顯示，Pdots的細(xì)胞毒性最小，靜態(tài)溶血試驗(yàn)結(jié)果顯示，Pdots的溶血活性可忽略不計(jì)。此外，在注射Pdots的小鼠的主要器官的蘇木精和伊紅(H&E)染色圖像中未觀察到明顯異常。總之，這些結(jié)果表明聚乙二醇化m-PBTQ4F/CN-PPV Pdots是具有高亮度、光穩(wěn)定性和生物相容性的小尺寸探針，有望用于體內(nèi)成像應(yīng)用。

 

首先進(jìn)行預(yù)處理以抑制圖像中的背景信號(hào)并增強(qiáng)血管的幾何特征。進(jìn)一步估計(jì)一系列的尺度因子，構(gòu)造了平滑的高斯核，然后與圖像進(jìn)行卷積，得到Hessian矩陣的元素。然后，考慮管狀結(jié)構(gòu)的具體情況，推導(dǎo)出Hessian矩陣的特征值，最終得到血管增強(qiáng)圖像。

作者通過(guò)使用Pdots探針和Hessian矩陣方法展示了活小鼠的高對(duì)比度全身血管成像。。在靜脈注射Pdots探針的小鼠的NIR-II熒光圖像中，雖然注射的Pdots屬于最亮的熒光團(tuán)，但原始圖像中幾乎無(wú)法將熒光信號(hào)較弱的小血管與周圍背景區(qū)分開，經(jīng)Hessian矩陣法處理后，原始圖像中的許多小直徑血管和模糊血管均得到明顯增強(qiáng)。從仰臥位的同一只小鼠的原始圖像和增強(qiáng)圖像中，血管結(jié)構(gòu)明顯增強(qiáng)，而來(lái)自肝臟的信號(hào)受到抑制，因?yàn)樵摲椒ㄖ荒芴崛【哂泄軤罱Y(jié)構(gòu)的目標(biāo)。圖像處理后兩條小血管的SBR較原圖像增強(qiáng)了約13倍，說(shuō)明Hessian矩陣算法對(duì)于提高全身熒光血管成像中弱小熒光血管的SBR有很強(qiáng)的效果。

圖5. 顱骨和頭皮完整的小鼠的腦脈管系統(tǒng)的體內(nèi)NIR-II熒光圖像。(a)野生型C57BL/6小鼠和ND2:SmoA1小鼠的腦脈管系統(tǒng)NIR-II熒光圖像以及(b)放大圖像。(c)使用血管分割和量化算法，對(duì)野生型和荷瘤小鼠的腦血管系統(tǒng)中的血管長(zhǎng)度和血管分支進(jìn)行定量比較。

 

接下來(lái)，作者使用NIR-II Pdots和Hessian矩陣法探索了小鼠腦深部組織血管成像。對(duì)正常小鼠和攜帶腦腫瘤的轉(zhuǎn)基因ND2:SmoA1小鼠進(jìn)行了頭皮和顱骨腦部成像。與野生型動(dòng)物相比，由于腫瘤的發(fā)展，ND2:SmoA1小鼠顯示出更扭曲和紊亂的腦脈管系統(tǒng)，從原始熒光圖像中很難識(shí)別橫竇和小直徑血管的輪廓，經(jīng)Hessian矩陣法圖像處理后，原始圖像中多條小血管明顯增強(qiáng)，橫竇結(jié)構(gòu)清晰。為了評(píng)估腫瘤生長(zhǎng)中的血管形態(tài)，還定量分析了血管長(zhǎng)度和血管分支，這些在原始圖像中是無(wú)法獲得的，因?yàn)樗鼈兊膱D像對(duì)比度低。從增強(qiáng)圖像中提取的血管長(zhǎng)度和血管分支統(tǒng)計(jì)分析表明，轉(zhuǎn)基因腦腫瘤小鼠的這兩個(gè)參數(shù)均顯著高于野生型小鼠。血管形態(tài)的定量評(píng)估為研究腫瘤血管生成和診斷腫瘤惡性提供了一種有效方法。

 

 

接下來(lái)，進(jìn)一步證明了使用NIR-II Pdots和Hessian矩陣方法在體外可視化大鼠肝臟血管結(jié)構(gòu)的可行性。由于肝組織的強(qiáng)散射和吸收以及肝血管的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，肝血管成像是一項(xiàng)復(fù)雜的任務(wù)。原始圖像在高度混濁的肝組織中顯示出非常弱的熒光信號(hào)，而Hessian-matrix增強(qiáng)圖像顯示出高得多的SBR，肝血管成像中SBR的20倍以上增強(qiáng)。這些結(jié)果驗(yàn)證了Hessian矩陣用于血管成像的有效性，并為研究肝臟疾病中血管結(jié)構(gòu)的發(fā)展提供了工具。

圖7. (a)顱骨完整的SD大鼠的腦脈管系統(tǒng)的體內(nèi)NIR-II熒光圖像和Hessian基質(zhì)增強(qiáng)圖像與(b)橫截面強(qiáng)度分布。(c)大鼠切除的腦組織的亮場(chǎng)和熒光圖像。(d) H&E染色圖像。(e)健康大鼠和荷瘤大鼠腦切片熒光圖像。

 

最后，作者探索了大鼠模型中原位成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的顱骨內(nèi)腦血管成像。由于顱骨更厚且光子散射更強(qiáng)，因此將大鼠腦可視化比將小鼠腦可視化更具挑戰(zhàn)性。圖像經(jīng)Hessian矩陣法處理后，原始圖像中的小直徑血管明顯增強(qiáng)，腦血管結(jié)構(gòu)更加清晰可見且增強(qiáng)圖像中的SBR有明顯改善，與小鼠腦和肝血管成像結(jié)果一致。此外，進(jìn)行離體NIR-II熒光成像，在來(lái)自不同組的切除的腦器官的亮場(chǎng)和熒光圖像中，模型組腫瘤部位可見亮熒光，而對(duì)照組和假組未檢測(cè)到明顯信號(hào)。該結(jié)果表明，由于滲透性和滯留性增強(qiáng)(EPR)效應(yīng)，Pdots在腦腫瘤中有效蓄積。對(duì)照組和荷瘤組腦切片的H&E染色圖像，證實(shí)了腦中腫瘤的發(fā)展。除了鏈?zhǔn)蕉逊e調(diào)制時(shí)，CN-PPV聚合物的混合也賦予Pdots橙色發(fā)射，從而能夠通過(guò)常規(guī)共焦成像對(duì)組織切片進(jìn)行顯微鏡檢查，腦切片的共焦熒光圖像表明Pdots在腦腫瘤中明顯積聚。總之，這些結(jié)果證明了使用NIR-II熒光Pdots和Hessian矩陣法進(jìn)行的大鼠腦高對(duì)比度顱骨血管成像。

總結(jié)：作者設(shè)計(jì)了熒光Pdots并且開發(fā)了一種圖像算法，用于小動(dòng)物的高對(duì)比度血管成像。作者提出了一種聚合物共混策略，該策略可以有效地調(diào)節(jié)大的剛性NIR-II半導(dǎo)體聚合物的鏈堆積行為，產(chǎn)生用于小血管體內(nèi)熒光成像的致密明亮的Pdots。此外，作者開發(fā)了一種有效的Hessian矩陣方法來(lái)增強(qiáng)血管結(jié)構(gòu)的圖像對(duì)比度，特別是小的和弱熒光的血管。在全身小鼠成像中，與原始圖像相比，增強(qiáng)的血管圖像在SBR中表現(xiàn)出超過(guò)一個(gè)數(shù)量級(jí)的改善。進(jìn)一步證明了使用NIR-II Pdots和Hessian矩陣法離體可視化大鼠肝臟血管結(jié)構(gòu)的可行性。原始圖像顯示高度混濁的肝組織的血管網(wǎng)絡(luò)非常模糊，而Hessian矩陣圖像在肝血管成像中顯示SBR增強(qiáng)20倍以上。利用明亮的Pdots和Hessian矩陣法，最終進(jìn)行了顱骨內(nèi)熒光成像，并在荷腦腫瘤的小鼠和大鼠模型中獲得了高對(duì)比度的腦脈管系統(tǒng)。本研究將成像算法與NIR-II熒光Pdots相結(jié)合，顯示出其在體內(nèi)促進(jìn)腫瘤血管生成及其他微循環(huán)相關(guān)疾病定量成像與研究的潛力。

 

參考文獻(xiàn)

Chen, D.; Qi, W.; Liu, Y.; Yang, Y.; Shi, T.; Wang, Y.; Fang, X.; Wang, Y.; Xi, L.; Wu, C., Near-Infrared II Semiconducting Polymer Dots: Chain Packing Modulation and High-Contrast Vascular Imaging in Deep Tissues. ACS Nano 2023, 17 (17), 17082-17094.

 

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