Piezo1通過(guò)可溶性腺苷酸環(huán)化酶-IP3R2回路誘導(dǎo)內(nèi)皮對(duì)剪切應(yīng)力的反應(yīng)

血管內(nèi)膜的內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）持續(xù)暴露于局部流體剪切應(yīng)力的反復(fù)變化，毛細(xì)血管靜水壓力的變化，以及血管脈動(dòng)增加期間血管壁拉伸應(yīng)變的變化。Piezo1 是一種成熟的機(jī)械敏感通道，它在機(jī)械力的作用下，非選擇性地將Ca²⁺ 從細(xì)胞外環(huán)境轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。敲除小鼠中的Piezo1基因可降低剪切力引起的細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺ 的增加水平，并阻止了ECs對(duì)剪切力的形態(tài)學(xué)和細(xì)胞保護(hù)反應(yīng)。然而， 控制EC適應(yīng)Piezo1下游剪切應(yīng)力的信號(hào)機(jī)制仍然知之甚少。

剪切應(yīng)力誘導(dǎo)Ca²⁺ 通過(guò)機(jī)械敏感通道從細(xì)胞外環(huán)境進(jìn)入，以及誘導(dǎo)位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）膜上的肌醇1,4,5-三磷酸受體（IP3Rs）釋放Ca²⁺。一個(gè)基本問(wèn)題是，這兩種機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是否與調(diào)節(jié)EC對(duì)剪切應(yīng)力的適應(yīng)具有內(nèi)在聯(lián)系。Piezo1通道，與肌漿/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca²⁺ ATP酶（sarco/endoplasmic reticulum Ca²⁺-ATPase，SERCA）相互作用并調(diào)節(jié)其活性，可能激活細(xì)胞外環(huán)境中的Ca²⁺ 進(jìn)入和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)儲(chǔ)存中的Ca²⁺ 釋放。

在美國(guó)伊利諾伊大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)與再生醫(yī)學(xué)系的一項(xiàng)研究中，數(shù)據(jù)顯示，剪切應(yīng)力激活Piezo1導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺ 快速動(dòng)員進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，隨后通過(guò)sAC-cAMP敏感機(jī)制釋放ER Ca²⁺。這里描述的數(shù)據(jù)將Piezo1機(jī)械傳感與通過(guò)IP3R2通路 cAMP -依賴(lài)性ER Ca²⁺ 釋放聯(lián)系起來(lái)。這種Piezo1-sAC-IP3R2機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)回路在Akt信號(hào)的激活中起著關(guān)鍵作用，作為ECs對(duì)層流剪切應(yīng)力引起血管舒張的適應(yīng)性形態(tài)學(xué)反應(yīng)的一部分。相關(guān)研究成果發(fā)表在 iScience 期刊題為“Piezo1 induces endothelial responses to shear stress via soluble adenylyl Cyclase-IP3R2 circuit”。

首先，為了確定Piezo1在剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的ER Ca²⁺ 信號(hào)傳導(dǎo)中的作用，實(shí)驗(yàn)將內(nèi)皮細(xì)胞暴露于2 dyn/cm²、5 dyn/cm²和10 dyn/cm²的層流剪切力下。數(shù)據(jù)顯示，人肺動(dòng)脈內(nèi)皮 （HPAE）單層暴露于 5 和 10 dyn/cm² 的剪切力持續(xù)60 秒，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)熒光增加，表明[Ca²⁺]ER 增加。這些變化取決于施加的剪切力，且在暴露于2 dyn/cm²剪切的細(xì)胞中則不那么明顯。與以往的研究一致，Piezo1的耗竭顯著降低了胞質(zhì)Ca²⁺ 響應(yīng)剪切應(yīng)力而上升的趨勢(shì)。這些結(jié)果揭示了Piezo1在響應(yīng)剪切應(yīng)力時(shí)通過(guò)快速動(dòng)員Ca²⁺進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)調(diào)節(jié)Ca²⁺ 穩(wěn)態(tài)中的核心作用。

接下來(lái)，研究討論了利用Yoda1 激活Piezo1，是否可以誘導(dǎo)[Ca²⁺]ER的變化而不依賴(lài)于機(jī)械應(yīng)力。研究表明，Piezo1誘導(dǎo)Ca²⁺ 動(dòng)員進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的機(jī)制不同。因此，探討了基質(zhì)相互作用分子1（STIM1）的作用，結(jié)論是，在Piezo1激活后，STIM1并沒(méi)有促進(jìn)ER Ca²⁺ 的快速上升，但對(duì)于在ER Ca²⁺ 耗盡時(shí)補(bǔ)充ER Ca²⁺是必要的。然后討論了SERCA泵在調(diào)節(jié)Piezo1介導(dǎo)的ER Ca²⁺ 進(jìn)入中的作用。由于Piezo1和SERCA在體外和細(xì)胞中相互作用，Piezo1功能可能與SERCA泵的激活耦合。結(jié)果證明了毒胡蘿卜素（SERCA非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑）消除了Yoda1誘導(dǎo)的ER Ca²⁺ 升高，但對(duì)對(duì)ER Ca²⁺衰減沒(méi)有顯著影響。因此，SERCA活性是Piezo1介導(dǎo)的ER Ca²⁺ 升高而不是ER Ca²⁺ 衰減所必需的。

為了研究Piezo1下游ER Ca²⁺ 衰減的機(jī)制，缺失了內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)膜上高度表達(dá)的兩種肌醇三磷酸受體IP3R2和IP3R3。結(jié)果表明，IP3R3的缺失對(duì)Piezo1誘導(dǎo)的ER Ca²⁺ 衰減沒(méi)有影響，相比之下，IP3R2的耗盡顯著降低了ER Ca²⁺ 衰減的速率常數(shù)，而不影響ER Ca²⁺上升的速率常數(shù)（圖1 A-C）。同樣，在層流剪切應(yīng)力作用下，IP3R2的損耗顯著降低了ER Ca²⁺ 衰減的速率常數(shù)（圖1 D-F）。此外，與IP3R3耗盡相反，IP3R3耗盡對(duì)Piezo1介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)[Ca²⁺]i的變化沒(méi)有影響，而在Yoda1激活Piezo1或施加層流剪切應(yīng)力后，IP3R2的耗盡顯著降低了[Ca²⁺]i的增加。這些數(shù)據(jù)表明，IP3R2通路對(duì)于Piezo1機(jī)械或藥理激活后ER Ca²⁺ 釋放到細(xì)胞質(zhì)中至關(guān)重要。

圖1 Piezo1的激活通過(guò)IP3R2通道誘導(dǎo)ER Ca²⁺儲(chǔ)存釋放。

（A）用對(duì)照、IP3R2或IP3R3 siRNA預(yù)處理的內(nèi)皮單層，用Yoda1激活Piezo1后G-CEPIA1er的活細(xì)胞圖像。（B）[Ca²⁺]ER在（A）中的時(shí)間過(guò)程。（C）由（B）數(shù)據(jù)計(jì)算的ER Ca²⁺ 衰變速率常數(shù)。（D）10 dyn/cm²層流剪切作用60 s后，對(duì)照組和IP3R2缺陷內(nèi)皮細(xì)胞G-CEPIAer的活細(xì)胞圖像。（E）[Ca²⁺]ER在（D）中的時(shí)間過(guò)程。（F）由（E）中數(shù)據(jù)計(jì)算的ER Ca²⁺ 衰變速率常數(shù)。

此外，為了研究Piezo1下游內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca²⁺釋放的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，探討了環(huán)磷酸腺苷（cAMP）通過(guò)IP3R2儲(chǔ)存增敏內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣釋放的作用。由于Ca²⁺ 直接刺激可溶性腺苷酸環(huán)化酶（sAC），因此確定了通過(guò)Piezo1的Ca²⁺ 內(nèi)流是否激活sAC并誘導(dǎo)cAMP的產(chǎn)生。結(jié)果表明，Yoda1增加了內(nèi)皮單層中cAMP傳感器的GFP強(qiáng)度，表明cAMP的生成增加（圖2 A）。此外，sAC的耗盡顯著減少了Yoda1誘導(dǎo)的cAMP的產(chǎn)生（圖2 A、B），表明 sAC 在Piezo1激活下游介導(dǎo)cAMP的產(chǎn)生中起著至關(guān)重要的作用。此外，對(duì)sAC的抑制顯著降低了ER Ca²⁺ 衰減的速率常數(shù)（圖2 C、E），并延遲了藥理或剪切介導(dǎo)的Piezo1激活后細(xì)胞質(zhì) [Ca²⁺]i 的增加。因此，sAC活化對(duì)于Piezo1誘導(dǎo)的cAMP 生成和通過(guò)cAMP敏化的IP3R2存儲(chǔ)釋放Ca²⁺ 至關(guān)重要。

圖2 Piezo1的激活誘導(dǎo)sAC依賴(lài)性產(chǎn)生cAMP和cAMP誘發(fā)的ER Ca²⁺ 釋放。

（A）在對(duì)照組和sAC 缺失的內(nèi)皮單層中，Yoda1激活Piezo1后cAMP濃度隨時(shí)間的變化。（B）（A）中cAMP濃度的相對(duì)變化。（C）在對(duì)照組和sAC 缺失內(nèi)皮單層中，Yoda1（箭頭）激活Piezo1后G-CEPIA1er的活細(xì)胞圖像。（D）[Ca²⁺]ER在（C）中的隨時(shí)間變化。（E）由(C)中數(shù)據(jù)計(jì)算的ER Ca²⁺ 衰減速率常數(shù)。

缺失Piezo1的ECs不能誘導(dǎo)Akt1磷酸化，并向?qū)恿鞣较蚺帕�。因此，最后�?shí)驗(yàn)想要確定ER Ca²⁺ 釋放和Akt1活性是否需要由血流誘導(dǎo)的ECs的適應(yīng)性重定向。與靜態(tài)條件下生長(zhǎng)的內(nèi)皮單層相比，HPAE和HAE單層在10 dyn/cm²剪切應(yīng)力作用24小時(shí)后，細(xì)胞排列發(fā)生了變化。然而，在Piezo1或IP3R2缺失的細(xì)胞中，細(xì)胞排列丟失。

由于Piezo1或IP3R2的缺失阻止了剪切誘導(dǎo)的Akt激活和ECs在流動(dòng)方向上的排列，接下來(lái)討論了Akt激酶在介導(dǎo)剪切應(yīng)力適應(yīng)性形態(tài)反應(yīng)中的作用。結(jié)果表明，Piezo1或IP3R2的缺失都通過(guò)限制Akt信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)阻止ECs對(duì)剪切應(yīng)力的適應(yīng)性反應(yīng)。

此外，為了解決Piezo1在調(diào)節(jié)Akt介導(dǎo)的ECs對(duì)層流剪切應(yīng)力的反應(yīng)中的生理意義，將空對(duì)照載體或myr-Akt1轉(zhuǎn)導(dǎo)到從內(nèi)皮限制性敲除的Piezo1小鼠（Piezo1ΔEC）分離的腸系膜血管的ECs中，與對(duì)照野生型（WT）小鼠相比，前者對(duì)增加的流體剪切的血管舒張反應(yīng)顯著降低。實(shí)驗(yàn)觀察到myr-Akt1的表達(dá)，而不是對(duì)照載體的表達(dá)，使體外腸系膜血管的血流誘導(dǎo)的血管舒張反應(yīng)恢復(fù)到對(duì)照血管的水平。這些數(shù)據(jù)表明，Piezo1-sAC-IP3R2回路負(fù)責(zé)ECs中Akt1信號(hào)的激活，從而負(fù)責(zé)血管對(duì)血流變化的空間和時(shí)間響應(yīng)。

圖3 圖形概要

在這里，該研究表明，機(jī)械敏感通道Piezo1被確定的剪切力激活誘導(dǎo)Ca²⁺ 通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca²⁺ ATPase 泵進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）。該入口之后是肌醇三磷酸受體2 （IP3R2）誘導(dǎo)的ER Ca²⁺ 釋放到細(xì)胞質(zhì)中。ER Ca²⁺ 釋放的機(jī)制涉及可溶性腺苷酸環(huán)化酶（sAC）產(chǎn)生cAMP，導(dǎo)致IP3R2 誘發(fā)的Ca²⁺ 門(mén)控。耗盡 sAC 或 IP3R2 可阻止ER Ca²⁺ 釋放并阻斷EC在流動(dòng)方向上的對(duì)齊。在內(nèi)皮受限的Piezo1敲除小鼠中，過(guò)表達(dá)組成型活性Akt1可恢復(fù)缺乏Piezo1或IP3R2的ECs的剪切誘導(dǎo)排列，以及血流誘導(dǎo)的血管舒張（圖3）。這些研究描述了一種未知的Piezo1-cAMP-IP3R2回路作為激活A(yù)kt信號(hào)傳導(dǎo)并誘導(dǎo)ECs對(duì)層流的適應(yīng)性變化的基本機(jī)制。

參考文獻(xiàn)：Santana Nunez D, Malik AB, Lee Q, Ahn SJ, Coctecon-Murillo A, Lazarko D, Levitan I, Mehta D, Komarova YA. Piezo1 induces endothelial responses to shear stress via soluble adenylyl Cyclase-IP3R2 circuit. iScience. 2023 Apr 11;26(5):106661. doi: 10.1016/j.isci.2023.106661. PMID: 37168565; PMCID: PMC10164902.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37168565/

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