在創(chuàng)新 HTRF 測定開發(fā)中采用低體積液體處理自動化的成本效益分析

介紹
 
免疫測定法的開發(fā)非常具有挑戰(zhàn)性，這是因為獲得特定信號需要正確組合樣品和檢測底物。
 
多年來，Cisbio 開發(fā)了數(shù)百種測定方法。在本應(yīng)用說明中，我們將展示 MANTIS® 液體處理器及其大容量芯片更換器 (LC3) 配件如何幫助我們在以下所有關(guān)鍵點上改進(jìn)我們的工藝：可重復(fù)性、時間、成本和減少操作者肌肉骨骼疾病。在這里，我們將重點介紹兩種類型的均相時間分辨熒光 (HTRF)®檢測分析：生物標(biāo)志物和磷蛋白分析。 HTRF 將 TR-FRET（時間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移）的熒光靈敏度、時間分辨率和低背景特性與 FRET（熒光共振能量轉(zhuǎn)移）的同質(zhì)性結(jié)合在一起。  
背景知識
 
HTRF 使用兩個熒光團(tuán)，一個能量供體和一個能量受體，它們在彼此靠近時轉(zhuǎn)移能量。這創(chuàng)建了一種同質(zhì)的測定形式，其中結(jié)合和未結(jié)合的分子不需要分開，因為來自受體的熒光發(fā)射僅在分子結(jié)合時產(chǎn)生。
 
每種測定都使用夾心形式，其中兩種抗體用HTRF專用熒光團(tuán)標(biāo)記。生物標(biāo)志物檢測使用兩種對目標(biāo)蛋白質(zhì)具有特異性的抗體（參見圖 2A），而磷蛋白分為兩種測定方法（參見圖2B）。其中第一個測定方法是磷酸化試劑盒，在試劑盒中一種抗體靶向磷酸化位點，而另一種抗體靶向整個蛋白質(zhì)。
 
     
磷蛋白測定中的第二個測定方法是總測定試劑盒，它使用兩種抗體靶向目標(biāo)蛋白上的兩個獨立表位。為了獲得一對功能正常的抗體配對，我們通常篩選 10 種抗體用于生物標(biāo)志物測定。每種抗體都用熒光團(tuán)、穴狀化合物和d2標(biāo)記。HTRF 供體熒光團(tuán)穴狀化合物由稀土配合物組成，其中嵌入了鑭系離子，如銪或鋱，并產(chǎn)生 1 至 2 毫秒范圍內(nèi)的長壽命發(fā)射，這是時間分辨檢測的基本特征。d2 HTRF 受體由于其小尺寸和設(shè)計，在免疫競爭性測定中具有更高的穩(wěn)定性，并且在某些情況下會提高測定靈敏度。
 
對于磷酸化蛋白分析，我們測試了五種磷酸化抗體和五種總抗體。
 
為了測試這些抗體配對，我們使用重組蛋白作為生物標(biāo)志物，使用細(xì)胞裂解物作為磷酸化蛋白。這些樣品中的每一個都被稀釋兩次以評估動態(tài)范圍。這些稀釋會在最終用戶實施的培養(yǎng)基中進(jìn)行（例如，用于分泌生物標(biāo)志物的培養(yǎng)基，或用于細(xì)胞內(nèi)磷酸蛋白的裂解緩沖液）。由于HTRF使用同質(zhì)形式的一步檢測實驗方案，因此緩沖區(qū)組成可能對信號產(chǎn)生巨大影響。因此，我們開發(fā)了 4 種裂解緩沖液來匹配任何抗體對去污劑的敏感性。
 
討論
 
在使用MANTIS之前，我們使用 384 孔板，一式三份。所有這些孔板加起來，其中1080 個孔將留給生物標(biāo)志物試劑盒 ，3360 個孔留給為磷酸化/總篩選。3 到 9 號之間的微孔板編號 (見圖3)。
   
此實驗設(shè)計不可能在一次操作中完成，而且最多需要 3 天才能進(jìn)行一次篩選。因為多通道移液器不適合我們的操作，所以我們使用重復(fù)液體分配器完成這些操作，比如Eppendorf的Multipette。2 µL 精確分液的精度太低，板孔之間的交叉污染過多。
 
因此，對于單塊384 孔板，需要混合三種試劑，每塊板總共有 1152 次移液動作。一年后，操作者的肌肉骨骼疾病成為了我們實驗室的一個真正需要正視的問題。
 
由于 MANTIS 能夠分配到 1536 孔板形式中，因此我們能夠按比例縮小 1536 孔尺寸的測定體積。
 
我們能夠?qū)Ⅲw積從 16 µL 樣品和 2 µL 每種抗體減少到 4 µL 樣品和 0.5 µL 每種抗體，而不會造成任何損失。此外，由于MANTIS 分配 5 µL 比分配 4 µL 更快，我們選擇了它來完成我們的實驗方案。(見 圖 4)  
所以，我們準(zhǔn)備好了。使用 1536 孔板，一次完整的篩選只需要 1 到 3塊微孔板，每塊板只需大約 30 分鐘即可完成分配。這個時間還包含了自動芯片清洗時間，在這段時間內(nèi)用戶可以自由地做其他事情。顯示實驗設(shè)置的磷蛋白測定示例和結(jié)果如下所示 (見 圖 5)。
   
總結(jié)
 
在一年多的工作里我們對這些改進(jìn)進(jìn)行了總結(jié)，這些總結(jié)包含了針對每種類型的至少十個項目，我們在許多層面上節(jié)省了時間、金錢和大量的勞動。
 
在使用MANTIS 之前，這些項目消耗了 130塊384 孔板。通過改用 1536 孔板，我們成功將消耗的板數(shù)量減少 75%。(見 圖 6A)。這一數(shù)量的板轉(zhuǎn)為總共分配的44400個板孔。 每個板孔需要三次分液，總共13.32萬次，這些全部由MANTIS操作完成，而非人工操作(見 圖 6B)。   由于 MANTIS 芯片被設(shè)計成能夠清潔和使用多達(dá) 100 萬次分液循環(huán)，因此我們不必再擔(dān)心耗材成本 (見圖6C)。以前我們使用非常昂貴的重復(fù)分液器吸頭，但是，當(dāng)使用 MANTIS時，我們只需要一個標(biāo)準(zhǔn)吸頭來處理在使用時添加到芯片中的每種試劑。我們還減少了試劑浪費，因為通常試管中的死體積可達(dá) 200 µL，但使用MANTIS，其死體積僅有 20 µL。再加上通過將 HTRF 試劑體積除以四來縮小我們的測定規(guī)模，我們節(jié)省了超過 1500 µg 的標(biāo)記抗體 (見圖 6D)。 
 
還通過在一次操作中進(jìn)行全面篩選，我們估計節(jié)省了 25 天的手動工作量，這樣就不必拆分操作以便由研究人員手動執(zhí)行(見圖6E)。手動分配需要許多控制和校正步驟，而 MANTIS 提高了可靠性，且將誤差降至最低。
 
總之，MANTIS 正在成為我們實驗室真正的游戲規(guī)則改變者。液體處理器使我們能夠在各個方面改進(jìn)我們的流程，考慮到一些我們熟知的不可能手動執(zhí)行的操作，MANTIS會幫助到我們開辟新的可能性。