常見的小核酸固相合成方法介紹

近年來由于核酸修飾和遞送載體的突破，帶來了變革性療法的創(chuàng)新浪潮，其中被認(rèn)為是繼小分子藥物、抗體藥物之后第三代創(chuàng)新藥物核酸藥物迎來了爆發(fā)式增長(zhǎng)，其優(yōu)勢(shì)在于廣泛的可成藥靶點(diǎn)、特異性強(qiáng)、安全性高、效果持久、開發(fā)成功率高和制造成本低等。寡核苷酸藥物，即小核酸藥物，是由十幾個(gè)到幾十個(gè)核苷酸串聯(lián)組成的短鏈核酸，目前小核酸藥物主要包括 RNAi 藥物和 ASO 藥物，作用于pre-mRNA或mRNA，通過干預(yù)靶標(biāo)基因表達(dá)實(shí)現(xiàn)疾病治療目的。

目前小核酸藥物大多通過亞磷酰胺三酯合成法進(jìn)行合成�；瘜W(xué)合成按照3'-5'的方向進(jìn)行。

常用的固相載體為可控微孔玻璃珠（CPG）或者聚苯乙烯微珠（PS beads），固相載體通過linker與初始核苷酸核糖的3'-OH共價(jià)結(jié)合，而核糖的2'-OH用諸如叔丁基二甲基硅基(TBDMS)的保護(hù)試劑進(jìn)行保護(hù)，或是核糖的2端有甲氧基、F代、甲氧乙基等修飾，5'-OH則用雙甲氧基三苯甲基（DMT）保護(hù)。此外，由于腺嘌呤、鳥嘌呤和胞嘧啶存在伯氨基團(tuán)，也需要用�；�試劑（例如苯甲酰基）進(jìn)行保護(hù)。

使用溶解在二氯甲烷/甲苯中的二氯乙酸（DCA）或三氯乙酸（TCA）移除核糖5端的DMT基團(tuán)，暴露5'-OH，以供下一步偶聯(lián)。脫保護(hù)時(shí)間取決于流速和柱子尺寸，反應(yīng)時(shí)間不夠/脫保護(hù)劑酸性太弱會(huì)產(chǎn)生n-1雜質(zhì)（與完整長(zhǎng)度為n的寡核苷酸相比僅相差一個(gè)核苷酸）；反應(yīng)時(shí)間太長(zhǎng)/脫保護(hù)劑酸性太強(qiáng)則導(dǎo)致序列中脫嘌呤的產(chǎn)生。反應(yīng)完成后，用乙腈洗滌去除殘留的脫保護(hù)劑，此步驟中乙腈含水量一般小于20ppm，乙腈需要使用較高流速去沖洗合成柱，脫保護(hù)試劑沖洗不干凈導(dǎo)致n+雜質(zhì)的產(chǎn)生。

合成目標(biāo)的原料，亞磷酰胺保護(hù)核苷酸單體，與活化劑四氮唑混合，得到核苷亞磷酸活化中間體，它的3端被活化，5端羥基仍然被DMT保護(hù)，與溶液中游離的5端羥基發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)。為了保證較高的總產(chǎn)率，每個(gè)循環(huán)中都需要有較高的偶聯(lián)效率。n-1雜質(zhì)是偶聯(lián)中最常見的雜質(zhì)，它們是偶聯(lián)效率低于100%的結(jié)果。與FLP相比，更高分子量的雜質(zhì)（例如n+1）也存在于偶聯(lián)步驟中，n+雜質(zhì)的形成歸因于活化劑四氮唑的弱酸性能移除一部分亞磷酰胺溶液中的DMT基團(tuán)。

偶聯(lián)反應(yīng)后新加上的核苷酸通過亞磷酯鍵（三價(jià)磷）與固相載體上的寡核苷酸鏈相連。亞磷酯鍵不穩(wěn)定，易被酸、堿水解，在下一個(gè)循環(huán)的脫保護(hù)酸性環(huán)境中不穩(wěn)定，因此需要被氧化成穩(wěn)定的五價(jià)的磷。磷酸二酯鍵中的2-氰乙基保護(hù)基團(tuán)可以使其在后續(xù)合成中更穩(wěn)定。常用碘溶液將亞磷酰轉(zhuǎn)化為磷酸三酯，得到穩(wěn)定的寡核苷酸。此外通過將一個(gè)硫原子轉(zhuǎn)移到P（三價(jià)）上也可以將其轉(zhuǎn)化為P（五價(jià)），從而形成硫代磷酸酯鍵。氧化劑與固相載體的接觸時(shí)間通常為1-4分鐘。

由于不可能達(dá)到100%的偶聯(lián)效率，仍存在脫保護(hù)后沒有反應(yīng)的5'-OH活性基團(tuán)（一般少于2%），如果不加處理，那這些基團(tuán)在下一個(gè)循環(huán)中仍能發(fā)生偶聯(lián)，產(chǎn)生n-1雜質(zhì)。通常使用兩種試劑（通常使用醋酸酐和N-甲基咪唑的混合液作為加帽試劑）來�；�5'-OH。

經(jīng)過以上四個(gè)步驟，一個(gè)核苷酸堿基被連接到固相載體的核苷酸上，再以酸脫去它的5'-羥基上的保護(hù)基團(tuán)DMT，重復(fù)以上步驟，直到所有要求合成的堿基被接上去。

核酸合成系統(tǒng)就是將上述一系列化學(xué)合成過程進(jìn)行自動(dòng)化，精準(zhǔn)化可控制的設(shè)備。儀器主要由柱塞系統(tǒng)泵、試劑閥、單體閥、試劑循環(huán)閥、紫外檢測(cè)器、電導(dǎo)率、惰性氣體控制盒、壓力監(jiān)測(cè)器、合成柱及軟件控制系統(tǒng)等多個(gè)部分組成。

大規(guī)模寡核苷酸合成系統(tǒng)采用流穿合成技術(shù)，泵精度高，規(guī)模廣泛，滯留體積低，適用于不同規(guī)模和類型的寡核苷酸。其以靈活簡(jiǎn)便的方式創(chuàng)建和轉(zhuǎn)移方法，為工藝開發(fā)和優(yōu)化提供支持，同時(shí)系統(tǒng)先進(jìn)的數(shù)據(jù)處理能力和分析工具可高效監(jiān)測(cè)和控制合成。

相關(guān)產(chǎn)品
英賽斯大規(guī)模核酸合成系統(tǒng)