小鼠模型在揭示MTHFD2通過抑制PTEN調(diào)控巨噬細胞極化研究中的應(yīng)用

巨噬細胞在體內(nèi)發(fā)揮著不同的功能，以響應(yīng)各種微環(huán)境刺激。近年來研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞可根據(jù)微環(huán)境的變化而改變其表型，這被稱為巨噬細胞極化。M1型巨噬細胞通常由IFN-γ或LPS或TNF-α激活，具有細胞毒性、促炎和抗腫瘤功能。M2型巨噬細胞則由IL-4或IL-13或IL-10交替激活，發(fā)揮清除寄生蟲、抗炎和促腫瘤作用。

巨噬細胞的極化受轉(zhuǎn)錄因子、信號級聯(lián)和代謝重編程的調(diào)控。一碳（1C）代謝包括葉酸循環(huán)和蛋氨酸循環(huán)等，在多種生理過程中發(fā)揮重要作用。一碳代謝酶MTHFD2（亞甲基四氫葉酸脫氫酶2）參與了腫瘤發(fā)生和免疫細胞功能的調(diào)控，但它是否能調(diào)控巨噬細胞極化目前仍是一個未知數(shù)。

近日，天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫系余秋景教授（現(xiàn)為電子科技大學(xué)附屬醫(yī)院·四川省人民醫(yī)院健康管理中心教授）和藥理系王霆教授以及天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院陳兵教授領(lǐng)導(dǎo)的團隊通過研究發(fā)現(xiàn)，MTHFD2是巨噬細胞極化的調(diào)節(jié)因子。它通過與PTEN催化中心相互作用調(diào)節(jié)PTEN活性，從而對巨噬細胞極化進行重編程。這項成果發(fā)表在《Cell Reports》雜志上，表明操控MTHFD2可作為一種策略來調(diào)節(jié)巨噬細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。
 

圖片來源：《Cell Reports》
（https://doi.org/10.1016/j.celrep.2023.112481）

研究材料
在此次研究中，研究人員將賽業(yè)生物提供的Mthfd2^fl/fl小鼠與Lyz2-Cre小鼠雜交，培育出髓系細胞特異性MTHFD2敲除小鼠（MTHFD2-KO-Mφ小鼠）。在此基礎(chǔ)上，通過構(gòu)建CCl₄誘導(dǎo)的肝纖維化模型、甲殼素模型和腫瘤移植模型。他們從小鼠身上采集骨髓，并使其分化為骨髓來源的巨噬細胞（BMDM）。他們通過免疫沉淀分析檢測到MTHFD2與PTEN的相互作用，并通過ClusPro蛋白對接分析、鏈霉親和素pull down和表面等離子體共振（surface plasmon resonance, SPR）等實驗確定了相互作用結(jié)構(gòu)域和關(guān)鍵位點。

技術(shù)路線
01 通過體外實驗探究MTHFD2如何調(diào)控小鼠巨噬細胞的極化
02 通過多個模型確定MTHFD2在體內(nèi)可抑制M1型巨噬細胞極化，并促進M2型極化
03 通過對Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分析發(fā)現(xiàn)MTHFD2可抑制PTEN的PIP3磷酸酶活性
04 蛋白相互作用分析表明，MTHFD2（aa 215-225）直接靶向PTEN催化中心（aa 118-141），且D168殘基對這種相互作用很重要

研究結(jié)果
1.MTHFD2在體外和體內(nèi)調(diào)節(jié)巨噬細胞的極化
研究人員首先分析了MTHFD2的表達和功能是否與巨噬細胞極化有關(guān)。在M1和M2極化模型中，MTHFD2的表達均升高，表明它可能是巨噬細胞極化的重要調(diào)節(jié)因子。利用siRNA抑制小鼠巨噬細胞系RAW264.7中的MTHFD2后，M1型標(biāo)志物Nos2和Il-6表達顯著上調(diào)，而M2型標(biāo)志物Arg1和Retnla表達顯著下調(diào)。

研究人員將賽業(yè)生物提供的Mthfd2^fl/fl小鼠與Lyz2-Cre小鼠雜交，培育出髓系細胞特異性MTHFD2敲除小鼠（MTHFD2-KO-Mφ小鼠）。他們發(fā)現(xiàn)，與WT小鼠（MTHFD2-WT-Mφ小鼠）相比，KO小鼠（MTHFD2-KO-Mφ小鼠）BMDMs中的M1型標(biāo)志物上調(diào)，而M2型標(biāo)志物被抑制。MTHFD2過表達則抑制M1型標(biāo)志物，但增強M2型標(biāo)志物表達。這些結(jié)果表明，MTHFD2可以調(diào)節(jié)巨噬細胞的極化。

為了進一步研究髓系MTHFD2是否調(diào)節(jié)體內(nèi)巨噬細胞的極化，研究人員在MTHFD2-KO-Mφ和MTHFD2-WT-Mφ小鼠上建立了腫瘤移植模型。與WT小鼠相比，KO小鼠的腫瘤生長較慢，腫瘤切片中的F4/80⁺巨噬細胞數(shù)量增加了近2倍（圖1）。表達iNOS的細胞數(shù)量明顯增加，而表達ARG1的細胞數(shù)量減少，這表明Mthfd2缺失會促進M1型巨噬細胞極化，并抑制M2型巨噬細胞極化。

由于表達ARG1的巨噬細胞在促進纖維化緩解方面發(fā)揮重要作用，故研究人員利用CCl₄誘導(dǎo)的肝纖維化模型來分析MTHFD2在調(diào)節(jié)M2表型上的作用。MTHFD2缺失導(dǎo)致ARG1陽性的巨噬細胞顯著減少，表明MTHFD2對M2表型有正向調(diào)節(jié)作用。此外，通過甲殼素模型的分析，他們發(fā)現(xiàn)髓系MTHFD2缺失會減少嗜酸性粒細胞的招募并降低ARG1的表達，進一步提示了MTHFD2在促進M2型巨噬細胞功能上發(fā)揮重要作用。
 

圖1 MTHFD2在體內(nèi)調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)巨噬細胞的極化^[1]

2.MTHFD2抑制PTEN的PIP3磷酸酶活性
之前的研究發(fā)現(xiàn)，Akt-mTORC1信號傳導(dǎo)對IL-4誘導(dǎo)的M2型極化至關(guān)重要。有意思的是，在MTHFD2-KO BMDM中，Akt^S473和Akt^T308的基礎(chǔ)磷酸化及IL-4誘導(dǎo)的磷酸化都明顯減弱。那么，Akt激活的減少是否與M2型極化缺陷有關(guān)？研究人員用Akt激活劑SC79處理MTHFD2-KO BMDM后，發(fā)現(xiàn)巨噬細胞極化的缺陷得以挽救，表明Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對MTHFD2缺失誘導(dǎo)的異常極化很關(guān)鍵。

蛋白激酶PI3K和PTEN可通過平衡PIP3的濃度來調(diào)節(jié)Akt的激活。他們發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)過IL-4和IFN-γ處理的MTHFD2-KO和WT細胞中，PI3K的表達和活性相當(dāng)，PTEN表達也相當(dāng)。然而在基礎(chǔ)條件和IL-4處理條件下，MTHFD2-KO細胞中PTEN的PIP3磷酸酶活性均高于WT細胞。與此相一致的是，PTEN的敲除可明顯挽救MTHFD2-KO細胞中的Akt磷酸化。綜上，這些結(jié)果表明，MTHFD2抑制了PTEN的PIP3磷酸酶活性，從而促進了Akt的激活。

3.MTHFD2直接靶向PTEN催化中心
通過共聚焦免疫熒光顯微鏡觀察和免疫沉淀分析，研究人員發(fā)現(xiàn)MTHFD2能夠與PTEN發(fā)生相互作用。通過構(gòu)建MTHFD2的N端缺失突變體（缺少線粒體靶向信號），他們發(fā)現(xiàn)MTHFD2與PTEN的結(jié)合以及PTEN的PIP3磷酸酶活性和Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)均不受影響。此外，IL-4刺激明顯增強了這種相互作用，而IFN-γ處理則沒有。由此可見，線粒體定位并不是MTHFD2與PTEN結(jié)合的必要條件，且IL-4處理促進了這種相互作用。

通過ClusPro蛋白對接分析，他們進一步發(fā)現(xiàn)MTHFD2的氨基酸殘基（aa 215-225）可直接靶向PTEN的催化中心（aa 118-141）（圖2）。鏈霉親和素pull-down和SPR分析發(fā)現(xiàn)，合成的PTEN（aa 118-141）生物素肽段能夠與胞內(nèi)或重組MTHFD2蛋白相互作用。同樣地，MTHFD2（aa 215-225）生物素肽段也能與胞內(nèi)或重組PTEN蛋白相互作用。與WT MTHFD2相比，缺乏aa 215-225的MTHFD2能夠顯著減少PTEN的PIP3磷酸酶活性降低。這些結(jié)果表明，MTHFD2直接靶向PTEN催化中心以降低PTEN的PIP3磷酸酶活性。
 

MTHFD2直接靶向PTEN催化中心并抑制PTEN的PIP3磷酸酶活性^[1]

MTHFD2需要無機磷酸鹽和鎂離子來支持其依賴于NAD的脫氫酶活性，而以往的研究發(fā)現(xiàn)MTHFD2 D168是鎂離子結(jié)合位點，而R201是無機磷酸鹽與NAD結(jié)合的主要位點。因此，研究人員通過突變分析來確定這些結(jié)合位點對MTHFD2與PTEN相互作用的重要性。他們發(fā)現(xiàn)，D168E突變體與PTEN的結(jié)合明顯減少。在MTHFD2-KO BMDM中，過表達MTHFD2可使M1型和M2型標(biāo)志物恢復(fù)到WT細胞的水平，但過表達D168E突變體只能部分恢復(fù)表型。從這些結(jié)果可以看出，MTHFD2 D168對于MTHFD2與PTEN的結(jié)合并抑制PTEN的PIP3磷酸酶活性很關(guān)鍵。

研究結(jié)論

圖3 MTHFD2調(diào)節(jié)巨噬細胞極化的機理示意圖^[1]

總的來說，這項研究通過體外和體內(nèi)研究揭示了MTHFD2的一個重要非代謝功能：它通過與PTEN的催化中心相互作用來調(diào)節(jié)PTEN活性，從而重編程巨噬細胞極化并改變巨噬細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)（圖3）。它表明調(diào)控MTHFD2可作為一種策略來調(diào)節(jié)巨噬細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。

原文檢索：
[1]Shang, M., Ni, L., Shan, X., et al. MTHFD2 reprograms macrophage polarization by inhibiting PTEN. Cell Rep. 2023 May 30;42(5):112481. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2023.112481