跨器官單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析應(yīng)用：揭示斑馬魚巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞異質(zhì)性

期刊：Cell Reports
影響因子：8.8

導(dǎo)語
組織駐留巨噬細(xì)胞 （TRM） 和樹突狀細(xì)胞 （DC） 具有高度異質(zhì)性，對免疫、組織再生和穩(wěn)態(tài)維持至關(guān)重要。本文通過單細(xì)胞RNA測序全面分析了成年斑馬魚器官中TRM和DC的異質(zhì)性。鑒定了兩個巨噬細(xì)胞亞群：在屏障組織、肝臟和心臟中具有組織再生特征的促炎性巨噬細(xì)胞和具有組織再生特征的促炎性巨噬細(xì)胞。同時，在這些器官中還觀察到一種具有突出抗原呈遞能力的常規(guī)樹突狀細(xì)胞 （cDC） 群體和具有抗病毒特性的漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞 （pDC）。值得注意的是，除了具有強(qiáng)大吞噬能力的單個巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞群外，在大腦中還鑒定出一個 pDC 細(xì)胞群和兩個不同的 cDC 群。本研究描繪了TRM和DC的景觀，并為深入研究斑馬魚中的這些細(xì)胞創(chuàng)造了有價值的工具。

技術(shù)方法
ScRNA-Seq

研究結(jié)果
1. scRNA-seq揭示了成年斑馬魚中不同的mpeg1.1+免疫細(xì)胞類型
從6個月大的Tg（mpeg1.1:DsRedx）魚的六個不同器官（包括三個屏障組織（表皮、鰓、腸）和三個內(nèi)臟（肝臟、心臟和大腦））中分離出來的mpeg1.1+細(xì)胞（一種被廣泛使用的髓系報告細(xì)胞系）進(jìn)行了基于液滴的scRNA-seq（圖1A）。在嚴(yán)格的質(zhì)量控制過濾和進(jìn)一步排除受污染的mpeg1.1-細(xì)胞后，研究者分別對每個器官中的高質(zhì)量mpeg1.1+細(xì)胞進(jìn)行無監(jiān)督聚類，研究的scRNA-seq數(shù)據(jù)顯示，Tg（mpeg1.1:DsRedx）報告基因標(biāo)記了八個不同的細(xì)胞群，包括三個單核髓細(xì)胞群（巨噬細(xì)胞、DC和中性細(xì)胞）、兩種淋巴細(xì)胞類型（B和NK樣[NKL]）和一個il6r+群，以及翻譯和循環(huán)簇。由于翻譯和循環(huán)簇可能代表巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的特定發(fā)育階段或功能狀態(tài)，研究者在此專門關(guān)注其他六個細(xì)胞群。
 

2. mpeg1.1+免疫細(xì)胞群在器官中高度保守
通過組合來自所有器官的mpeg1.1+群進(jìn)行比較分析，評估了同一細(xì)胞群在不同器官之間的轉(zhuǎn)錄相似性。Pearson相關(guān)分析顯示，來自不同器官的相同細(xì)胞群通常高度相關(guān)（圖2A）。這些群體的總體跨器官相似性表明，每個細(xì)胞群都有一個核心轉(zhuǎn)錄組特征，該特征定義了其身份，并賦予了跨器官的特殊功能，并揭示了可能參與其發(fā)育的譜系特異性TFs。
 

3. 屏障組織、肝臟和心臟中兩種不同功能的巨噬細(xì)胞亞群
從所有器官中提取了巨噬細(xì)胞群體，并以更高的分辨率重新聚集（圖3A）。由于腦內(nèi)的巨噬細(xì)胞——小膠質(zhì)細(xì)胞，與屏障組織、肝臟和心臟中的巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出相對不同的轉(zhuǎn)錄組特征（圖2A），分別討論了外周巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞。聚類顯示了兩種不同的巨噬細(xì)胞亞群，lgals3bpb+巨噬細(xì)胞和ccl34a.4+巨噬細(xì)胞，在屏障組織、肝臟和心臟中具有不同的分布模式（圖3A–3C），對這兩個吞噬細(xì)胞亞群之間的DEGs進(jìn)行了基因本體（GO）和京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。結(jié)果顯示lgals3bpb+巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出促炎作用，具有較強(qiáng)的吞噬作用和免疫細(xì)胞募集能力。另一方面，ccl34a.4+巨噬細(xì)胞最突出的特征是它們廣泛表達(dá)與組織重塑和再生有關(guān)的基因，包括與細(xì)胞生長和增殖（例如igf2b和hBegfa）、細(xì)胞外間質(zhì)重塑（例如timp2b、timp4.3和tgfbi）、傷口愈合（例如plecb和f13a1b）和免疫調(diào)節(jié)（例如cfp、ccl34a.4和ccl38.1）（圖3D和3F）

4. 斑馬魚中的cDCs和pDCs
為了更好地了解斑馬魚DCs的異質(zhì)性、分布、個體發(fā)育和功能，作者從每個器官中提取了DC群體，并重新進(jìn)行了聚類分析。與哺乳動物一樣，斑馬魚包含兩個主要的DC群：具有與抗原呈遞相關(guān)基因的cDCs（例如mhc2dab、cd74a）和基于其內(nèi)源性TLRs的獨(dú)特表達(dá)而定義的pDCs（tlr7.1和tlr9）在屏障組織、肝臟和心臟中，檢測到一個主要的cDC群，斑馬魚cDCs可能作為抗原呈遞細(xì)胞發(fā)揮作用，并可能發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用。另一方面，斑馬魚的pDCs顯著高表達(dá)組織蛋白酶Bb（ctsbb）和嘌呤受體蛋白P2X 3a（p2rx3a）（圖4B）。除了內(nèi)源性TLRs tlr7.1和tlr9（圖4D和S2B）的獨(dú)特表達(dá)外，哺乳動物pDCs的特征基因也富集于控制I型干擾素產(chǎn)生的干擾素調(diào)節(jié)因子（例如irf3和irf7）（圖4D和4E），表明它們在抗病毒應(yīng)答中的專門作用，這是哺乳動物pDCs的顯著功能。與只有一個cDC群的屏障組織、肝臟和心臟不同，大腦具有兩個不同的轉(zhuǎn)錄cDC亞群，cnn3a+cDCs和ccl35+cDCs，各類富集分析表明，成年斑馬魚大腦中含有吞噬小膠質(zhì)細(xì)胞和調(diào)節(jié)性DCs，它們具有深刻的腦特異性特征，并在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮特殊功能。
 

5. 為巨噬細(xì)胞和DC亞群生成特異性報告細(xì)胞系
通過鑒定成年斑馬魚中不同的巨噬細(xì)胞和DC亞群，接下來試圖產(chǎn)生特定的報告細(xì)胞系，用于這些細(xì)胞發(fā)育和功能的進(jìn)一步研究。選擇兩個分別在器官和所有TRMs的cDC群中高表達(dá)的基因ccl35.1和c1qb作為常見的cDC和泛巨噬細(xì)胞標(biāo)記。此外，選擇分別在促炎性巨噬細(xì)胞和促重塑巨噬細(xì)胞中明確表達(dá)的lgals3bpb和ccl34a.4作為巨噬細(xì)胞子集特異性標(biāo)記�；�于這些基因的熒光報告系是通過克隆其啟動子或利用其細(xì)菌人工染色體（BAC）載體來創(chuàng)建的。結(jié)果，獲得了四個報告系，TgBAC（ccl35.1:EGFP）、Tg（c1qb:EGFP）、Tg（lgals3bpb:EGFP）和TgBAC（ccl34a.4:EGFP），其可能分別標(biāo)記常見的cDCs、泛巨噬細(xì)胞、促炎巨噬細(xì)胞和促重塑巨噬細(xì)胞（圖6A-6D）。這些報告基因系忠實地再現(xiàn)了標(biāo)記基因的內(nèi)源性表達(dá)，并特異性標(biāo)記了指定的巨噬細(xì)胞或DC亞群，為研究這些不同髓系群的發(fā)育和功能提供了有力的工具。
 

總結(jié)
在這項研究中，作者利用scRNA-seq來破譯成年斑馬魚中TRM和DC的異質(zhì)性，在器官中鑒定了各種功能保守的 TRM 和 DC 亞群，并根據(jù)這些不同亞群的區(qū)分標(biāo)記生成了幾種巨噬細(xì)胞和 DC 特異性報告系。該研究增強(qiáng)了對斑馬魚中TRM和DC的理解，并為這些細(xì)胞的進(jìn)一步發(fā)育和功能表征提供了有價值的工具。

參考文獻(xiàn)：
Zhou Q, Zhao C, Yang Z, Qu R, Li Y, Fan Y, Tang J, Xie T, Wen Z. Cross-organ single-cell transcriptome profiling reveals macrophage and dendritic cell heterogeneity in zebrafish. Cell Rep. 2023 Jul 25;42(7):112793. doi: 10.1016/j.celrep.2023.112793. Epub 2023 Jul 14. PMID: 37453064.