HL-SAN耐高鹽核酸酶在高效去除宿主DNA等方面的應(yīng)用
描述
無論是實驗室規(guī)模樣品制備、還是生產(chǎn)規(guī)模工藝過程，去除核酸都可以改善工藝流程，如蛋白純化、病毒載體制備、mNGS中樣品處理等過程。而核酸酶的選擇，就顯得特別重要。Heat Labile-Salt Active Nuclease (熱不穩(wěn)定性耐高鹽核酸酶，HL-SAN) 是一種非特異性內(nèi)切酶，在高鹽濃度下具有最佳活性；且該酶在多種緩沖液中都有活性，很容易通過還原劑處理而失活。這些特性使HL-SAN在需要去除DNA和RNA的應(yīng)用中，更為適合。核酸污染，特別是宿主基因組DNA污染，在幾乎所有工藝流程及生物制品的生產(chǎn)中，都是需要重點解決的問題。一方面，宿主DNA的存在，影響目標(biāo)產(chǎn)物的純化及下游質(zhì)量分析等。另一方面，宿主DNA殘留能引起機體嚴(yán)重的免疫反應(yīng)，是生物制品的關(guān)鍵質(zhì)量參數(shù)之一，F(xiàn)DA及NMPA等對Host Cell DNA (HCD)有嚴(yán)格的質(zhì)控要求。宿主基因組DNA中，組蛋白與DNA形成核小體，核小體緊密折疊形成結(jié)構(gòu)復(fù)雜的染色質(zhì)。組蛋白與DNA間存在強烈的離子作用及疏水作用，再加上特殊的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致宿主DNA很難被準(zhǔn)確檢測并清除。已有文獻(xiàn)表明，高鹽濃度下組蛋白與DNA解離相對徹底，這有利于宿主DNA的檢測及去除。但市售的絕大多數(shù)核酸酶在高鹽濃度下活性很弱，甚至完全失活。而耐高鹽的HL-SAN成了這類應(yīng)用的理想選擇。
推薦應(yīng)用
1. 病原微生物診斷應(yīng)用，如宏基因組測序（mNGS）樣品去除宿主DNA；
2. 蛋白純化，特別是DNA結(jié)合蛋白；
3. 其他需要去除宿主DNA的應(yīng)用等。
優(yōu)勢
1. 高鹽條件下，宿主DNA去除更徹底；
2. pI為9.6，容易跟絕大多數(shù)蛋白分離；
3. 還原劑存在時，酶易失活，減少對后續(xù)流程的影響。
使用指導(dǎo)
1.DNA去除方案從細(xì)胞抽提物或細(xì)胞裂解液中去除DNA污染，HL-SAN的使用量受到多種因素影響，如細(xì)胞類型、裂解液組成、NaCl濃度、Mg2+濃度、裂解液pH等。參考方案見Figure 1。比如，對于1ml細(xì)胞裂解樣品，調(diào)整到0.3-0.75 M NaCl濃度，加入1000 U HL-SAN，15℃-37℃溫度條件下孵育30-60min，或者4℃過夜。Mg2+是必須的。
Figure 1. 不同樣品、不同去除要求下，HL-SAN的推薦濃度及反應(yīng)條件。（DNA removal的要求是指通過瓊脂糖凝膠電泳看不到條帶。Decontamination的去除要求是對23S rDNA進(jìn)行qPCR檢測為陰性。）
2.滅活滅活是通過添加還原劑（TCEP或DTT）來實現(xiàn)的，推薦用TCEP（因為TCEP在磷酸鹽溶液中不穩(wěn)定，特別在中性pH下）。不同工藝流程中，通過改變孵育時間、溫度和還原劑的濃度等來滅活該酶。一般情況下， 25-37℃反應(yīng)5-10分鐘，可以滅活99%以上的酶。為了避免酶恢復(fù)活性、再次激活，保持低濃度還原劑，如0.1-0.5 mM DTT或TCEP，或延長滅活反應(yīng)時間。
Figure 2. HL-SAN的滅活反應(yīng)條件
應(yīng)用實例：
高效去除人體DNA (99.99%)干擾、快速檢測下呼吸道感染（LRIs）病原呼吸道感染（RIs）病原的快速檢測一直是醫(yī)療中亟待解決的問題。RIs樣本類型眾多并且病原含量差別很大，同時帶有大量的人體細(xì)胞，因此搭建一套快速、高效的樣本處理系統(tǒng)對于通過高通量測序進(jìn)行病原檢測至關(guān)重要。2019年Nature Biotechnology文章報道了如下流程。為了盡可能去除宿主DNA、提高檢測靈敏度，在優(yōu)化實驗的人體宿主細(xì)胞去除、微生物DNA提取和nanopore測序等三個步驟都做了對應(yīng)的優(yōu)化，比如宿主DNA去除時找到了合適濃度的saponin (2.2%)，HL-SAN步驟由兩步減為一步，清洗步驟縮減為2次。最終，從拿到樣本到建庫完成縮短至6hr，且在最終檢測中達(dá)到了96.6%的敏感性和100%的特異性。
Figure 3. Nanopore宏基因組快檢流程
酶學(xué)特征
來源：Pichia pastoris酶比活：≥1.75 x 10^5 Units/mg酶活定義：在37℃，25mM Tris-HCl，pH8.5 (25℃)，5mM MgCl2，500mM NaCl反應(yīng)體系中，一個單位的HL-SAN在30分鐘內(nèi)消化50µg/ml的小牛胸腺DNA（Sigma， D-1501），產(chǎn)生OD260nm處1A的吸光值變化。特異性：非特異性內(nèi)切核酸酶，能夠?qū)捂溂半p鏈的DNA及RNA，消化成5個堿基為主的寡核苷酸oligos。酶活條件：（Effective是指活性在最優(yōu)活性10%以上的條件范圍）
References
1. Nanopore metagenomics enables rapid clinical diagnosis of bacterial lower respiratoryinfection. Charalampous T, Kay GL, O’Grady J. Nature Biotechnology. 2019;37: 783–792.
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