小動物活體成像技術(shù)在外泌體研究中的應(yīng)用

外泌體（Exosomes），是由活細胞分泌的一種脂質(zhì)雙分子結(jié)構(gòu)的胞外小泡（EV， Extracellular Vesicles），直徑約為30-150nm，廣泛存在于血液、唾液、尿液、腦脊液、精液、乳汁、羊水、肺泡灌洗液以及其他生物體液中。外泌體攜帶有多種蛋白質(zhì)、脂類、RNA等重要信息，不僅在細胞與細胞間的物質(zhì)和信息傳遞中起重要作用，更有望成為多種疾病的早期診斷標志物，或者作為藥物的天然載體用于治療。本文將為大家介紹如何運用活體成像技術(shù)進行外泌體相關(guān)內(nèi)容的研究。
 

一，外泌體示蹤

圖1 外泌體（EVs）的獲取和標記

目前針對外泌體（EVs）的分離和純化已經(jīng)有很多可選的成熟方法，針對其應(yīng)用和藥物開發(fā)也有大量的研究結(jié)果。那么，如何在不影響其生物分布的情況下，在體內(nèi)示蹤EVs是其作為藥物傳遞載體和治療藥物成功開發(fā)的關(guān)鍵。本研究借助影像學(xué)方法，分別評估了五種不同的光學(xué)和核示蹤劑標記方法對EVs體內(nèi)生物分布的影響。
 

圖2 熒光（mCherry、DIR）標記EVs的小鼠活體成像圖像

研究人員選用小動物活體成像系統(tǒng)評估了熒光和生物發(fā)光標記EVs在動物體內(nèi)的分布情況。使用熒光蛋白mCherry和熒光染料DIR標記EVs，通過活體圖像（2A、2E）、離體圖像（2B、2F）以及離體組織和組織裂解液熒光信號（2C、2D、2G、2H）的比較，可以清楚看到DIR標記的EVs在體內(nèi)的生物分布情況，而mCherry標記的EVs受到動物組織高水平背景熒光的限制，與PBS空白對照組沒有形成明顯的分布差異，因而不適用于EVs的體內(nèi)示蹤。
 

圖3 生物發(fā)光（Nanoluc）標記EVs的小鼠活體成像圖像

之后，研究人員選用了Nanoluc作為生物發(fā)光示蹤劑，用于EVs的體內(nèi)監(jiān)測。然而，由于Nanoluc產(chǎn)生的短波長不容易穿透動物組織，使得活體動物深層器官（包括肝臟，脾臟和肺）的成像受到了限制，Nanoluc標記的EVs在活體（3A）和離體（3B、C、D）水平表現(xiàn)出不同的生物分布。同時，對EVs的基因修飾會導(dǎo)致其表面蛋白組成發(fā)生變化，影響其自身生理和生物分布，表明轉(zhuǎn)基因融合標記的方法（NanoLuc、Firefly、mCherry）并不適用于標記EVs。本研究通過一系列體內(nèi)和體外影像檢測，發(fā)現(xiàn)DiR和放射性標記是EVs體內(nèi)成像最敏感的示蹤劑。

二，外泌體載藥

圖4 納米電穿孔芯片制備包載核酸的外泌體

外泌體作為一種內(nèi)源性的天然運載體，近年來備受青睞，成為體內(nèi)核酸藥物運輸?shù)囊环N新型工具。本研究開發(fā)了一種細胞納米穿孔方法，用于生產(chǎn)含有治療性mRNA和靶向肽的大量外泌體。相比傳統(tǒng)的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染或電轉(zhuǎn)，產(chǎn)生包載大片段基因（6-9kb）的外泌體數(shù)量能夠提升50倍左右。該方法具有普適性，經(jīng)驗證可在多種類型的細胞中顯著提高外泌體產(chǎn)率。
 

圖5 外泌體在小鼠體內(nèi)的靶向分布圖像

生產(chǎn)出外泌體之后，需要對其作為藥物載體的靶向效果進行驗證。研究人員使用PTEN基因缺失的人源腦膠質(zhì)瘤細胞系U87建立小鼠原位腦腫瘤模型，給予包載PTEN mRNA的外泌體，該外泌體經(jīng)轉(zhuǎn)基因編輯靶向肽以增強其靶向性（Exo-T），并用親脂質(zhì)型的熒光探針PKH26進行染色。利用小動物活體成像系統(tǒng)，研究人員對腦膠質(zhì)瘤在小鼠體內(nèi)的生長情況以及熒光標記的外泌體在小鼠體內(nèi)的分布情況進行了監(jiān)測。結(jié)果顯示，與PBS空白對照、傳統(tǒng)的載藥載體陽離子脂質(zhì)體（Turbo）以及未經(jīng)靶向改造的外泌體組(Exosome)對比，尾靜脈注射4小時后，兩組外泌體均有明顯的腦靶向，而加了靶向肽的外泌體則能夠更好的富集到小鼠腦部。離體組織成像及熒光定量分析均證實了該結(jié)果（圖5）。
 

圖6 包載PTEN mRNA的外泌體抑瘤效果評價

利用腫瘤細胞攜帶的螢光素酶報告基因，研究人員同時監(jiān)測了腫瘤的生長情況，以完成對不同處理組的藥效學(xué)評價。結(jié)果顯示，經(jīng)過靶向性改良的載藥外泌體具有顯著的抑瘤效果，并且一次給藥可以抑制腫瘤生長12天左右（圖6）。該系統(tǒng)的研發(fā)將有助于核酸藥物載體在臨床上的開發(fā)應(yīng)用。