文獻(xiàn)解讀：CAR-T細(xì)胞助力增強(qiáng)前列腺癌腫瘤細(xì)胞抗腫瘤能力

前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，在全球，前列腺癌的發(fā)病率在男性所有惡性腫瘤中高居第2位，僅次于肺癌。免疫檢查點(diǎn)分子轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子受體II（TGFβRII）、T細(xì)胞免疫球蛋白和粘蛋白結(jié)構(gòu)域3（TIM3）與前列腺癌的細(xì)胞免疫抑制有關(guān)，因此免疫治療作為一種新的治療方法逐漸表現(xiàn)出巨大的前景。

CAR-T治療又稱嵌合抗原受體T細(xì)胞治療，是將人的T細(xì)胞經(jīng)過基因工程手段體外修飾改造后，回輸患者體內(nèi)，達(dá)到治療疾病的目的。CAR-T療法作為癌癥的突破性治療手段，一直以來備受業(yè)內(nèi)外人士關(guān)注，隨著國內(nèi)第四款CAR-T產(chǎn)品獲批上市，CAR-T療法熱度持續(xù)升溫。

近日，皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院（弋磯山醫(yī)院）泌尿科和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中心的部分研究人員在《International Immunopharmacology》期刊上發(fā)表了題目為 “Dominant negative TGFβ receptor II and truncated TIM3 enhance the antitumor efficacy of CAR-T-cell therapy in prostate cancer” 的研究論文。該研究發(fā)現(xiàn)DT-PSMA-CAR-T細(xì)胞顯示出根除PSMA陽性的前列腺癌細(xì)胞的能力。此外，在體外移植GAL9-PSMA-PC3 細(xì)胞的免疫缺陷型小鼠實(shí)驗(yàn)中，DT-PSMA-CAR-T細(xì)胞也顯示出消除腫瘤組織的能力，延長(zhǎng)生存期，沒有顯著的副作用。
 

圖片來源：《International Immunopharmacology》
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圖1 CAR-T細(xì)胞的生產(chǎn)

研究結(jié)果 03
1. CAR-T細(xì)胞的生產(chǎn)制備并進(jìn)行表型分析鑒定
首先，作者進(jìn)行了CAR-T細(xì)胞的培養(yǎng)擴(kuò)增并對(duì)其進(jìn)行了表型分析。分為(i)UTD T細(xì)胞，(ii)PSMA-CAR-T細(xì)胞和(iii)DT-PSMA-CAR-T細(xì)胞。電穿孔后T細(xì)胞的擴(kuò)增，質(zhì)粒的插入對(duì)T細(xì)胞的擴(kuò)增有影響。檢測(cè)了分選后的T細(xì)胞上TIM3和TGFβRII的表達(dá)情況，三組T細(xì)胞的CD4和CD8表型，以及代表記憶T細(xì)胞的標(biāo)記物CD45RO�？偟膩碚f，三組T細(xì)胞的表型是相似的。
 

圖2 DT-PSMA-CAR-T的制備及表型鑒定

2. 腫瘤殺傷實(shí)驗(yàn)確定DT-PSMA-CAR-T強(qiáng)大抗腫瘤能力
作者分別研究了三組T細(xì)胞對(duì)TGFβRII和TIM3單獨(dú)作用及TGFβRII和TIM3聯(lián)合應(yīng)用后的抗腫瘤效率。

結(jié)果如下：
（1）DT可在體外消除TGFβRII對(duì)T細(xì)胞的抑制作用
在TGF-β濃度分別為0ng/ml和5ng/ml時(shí)，PSMA-CAR-T組和DT-PSMA-CAR-T組的腫瘤殺傷率相似（P>0.05）。在TGF-β濃度為20ng/ml和50ng/ml時(shí)，PSMA-CAR-T組的腫瘤殺滅率低于DT-PSMA-CAR-T組，在T細(xì)胞與靶細(xì)胞比例為1:1和5:1時(shí)差異更顯著（P≤0.05）。
 

圖3 不同TGF-β濃度對(duì)三組T細(xì)胞腫瘤殺傷效果對(duì)比

（2）DT可以消除TIM3對(duì)T細(xì)胞的抑制作用
在TIM3激活單克隆抗體濃度為10μg/ml和20μg/ml時(shí)，PSMA-CAR-T組的腫瘤裂解率低于DT-PSMA-CAR-T組，這與TGFβRII對(duì)T細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)影響相似。在T細(xì)胞與靶細(xì)胞比例為1:1和5:1時(shí)，差異更為顯著（P≤0.05)。
 

圖4 不同TIM3單抗?jié)舛葘?duì)三組T細(xì)胞腫瘤殺傷效果對(duì)比

（3）DT可以消除TGFβRII和TIM3對(duì)T細(xì)胞的抑制作用

TGFβRII和TIM3之間存在協(xié)同效應(yīng)。當(dāng)TGF-β和TIM3激活單克隆抗體聯(lián)合使用時(shí)，PSMA-CAR-T和UTD組對(duì)T細(xì)胞的抑制作用明顯強(qiáng)于TGF-β或TIM3單獨(dú)激活單克隆抗體（P≤0.05）。

圖5 TGFβRII和TIM3聯(lián)合使用對(duì)三組T細(xì)胞腫瘤殺傷效果對(duì)比

3. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)確定DT-PSMA-CAR-T可以消除TGFβR11和TIM3對(duì)T細(xì)胞的抑制作用
將DMEM-PSMA-PC3細(xì)胞皮下接種于小鼠背部。2周后，將所有小鼠隨機(jī)分為三組，分別靜脈靜脈注射（尾靜脈）：(i)UTD T細(xì)胞，(ii)PSMA-CAR-T細(xì)胞，(iii)DT-PSMA-CAR-T細(xì)胞。共觀察1個(gè)月，采用脊髓脫位法觀察未死于腫瘤的小鼠。每周通過腹腔注射熒光素進(jìn)行生物熒光成像，并使用Aniview100（bolteng儀器）定量發(fā)光。

根據(jù)生物發(fā)光成像結(jié)果，UTD組有1只小鼠在T細(xì)胞輸注后存活28天，而CAR-T組的所有小鼠均存活。
 

圖6 DT-PSMA-CAR-T腫瘤殺傷體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

結(jié)論 04
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在T細(xì)胞上過表達(dá)trTIM3和dnTGFβRII可以緩解TIM3和TGFβRII的免疫抑制作用，并在一定程度上改善了PSMA-CAR-T細(xì)胞的功能。作者認(rèn)為靶向多個(gè)抑制性免疫檢查點(diǎn)是提高細(xì)胞免疫治療療效的一種方法，該策略有利于難治性和復(fù)發(fā)性腫瘤患者，促進(jìn)細(xì)胞免疫治療產(chǎn)品的臨床應(yīng)用。

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