CAR-T細(xì)胞衍生外泌體的生物學(xué)功能及在各類(lèi)癌癥治療中的優(yōu)勢(shì)

原創(chuàng) 彪彪 文章來(lái)源：生物制品圈

摘要:嵌合抗原受體（CAR）-T細(xì)胞過(guò)繼免疫療法是一種有前景的癌癥治療方法，它利用基因工程化的T細(xì)胞攻擊腫瘤。然而，這種療法可能會(huì)有一些不良反應(yīng)。來(lái)源于CAR-T細(xì)胞的外泌體是CAR-T細(xì)胞的潛在替代品，可能克服一些限制。外泌體是細(xì)胞釋放的小囊泡，可以攜帶多種分子，包括蛋白質(zhì)、RNA和DNA。它們?cè)诩?xì)胞間通訊中扮演重要角色，并且可以用來(lái)向癌細(xì)胞輸送治療劑。應(yīng)用來(lái)源于CAR-T細(xì)胞的外泌體可以使CAR-T細(xì)胞療法在臨床上更加可控和有效。外泌體是無(wú)細(xì)胞的，這意味著它們比CAR-T細(xì)胞更不可能引起不良反應(yīng)。CAR-T細(xì)胞和外泌體的結(jié)合可能比單獨(dú)任一療法更有效地治療癌癥。外泌體可以向CAR-T細(xì)胞無(wú)法到達(dá)的癌細(xì)胞輸送治療劑。適當(dāng)應(yīng)用細(xì)胞和外泌體平臺(tái)可以使CAR-T細(xì)胞療法成為更實(shí)用的癌癥治療方法。這種組合療法可以為治療多種癌癥提供一種安全有效的方式。

1.引言

近年來(lái)，癌癥免疫療法已成為主要的治療選擇之一。其中最有前景的方法之一是嵌合抗原受體（CAR）-T細(xì)胞療法，該療法涉及工程化T細(xì)胞以靶向特定的癌細(xì)胞。然而，CAR-T細(xì)胞療法也可能產(chǎn)生一些不良反應(yīng)，如細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）。CRS的特點(diǎn)是細(xì)胞因子的快速和過(guò)量釋放，導(dǎo)致細(xì)胞因子風(fēng)暴。當(dāng)大量的促炎和炎癥細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-2（IL-2）、可溶性IL-2受體α（可溶性IL-2Rα）、干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、可溶性IL-6R和粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）被釋放到血液中時(shí)，就會(huì)發(fā)生細(xì)胞因子風(fēng)暴。細(xì)胞因子風(fēng)暴觸發(fā)免疫反應(yīng)，引起廣泛的炎癥和免疫細(xì)胞的激活。這種免疫超激活可能會(huì)攻擊重要器官，包括肺、肝、腎、心、腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)。外泌體是體內(nèi)許多細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞外囊泡。它們已被證明在細(xì)胞間通訊中發(fā)揮作用，并且可能能夠向癌細(xì)胞輸送治療性貨物。使用來(lái)源于CAR-T細(xì)胞的外泌體作為一種治療方法，可能會(huì)提供更多的治療過(guò)程控制，并幫助降低不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。外泌體是癌癥免疫療法中的一個(gè)有前景的新研究點(diǎn)，它們有可能徹底改變癌癥的治療方法。本綜述聚焦于CAR-T細(xì)胞和來(lái)源于CAR-T細(xì)胞的外泌體在癌癥模型中的治療潛力。

2.外泌體概述（內(nèi)容、生物合成和攝�。�

細(xì)胞外囊泡（EVs）的分類(lèi)主要分為兩大類(lèi)：外泌體和外泌體。外泌體通過(guò)質(zhì)膜的外向出芽形成，形成大小范圍約為50納米至1微米的微囊泡，而內(nèi)源性的外泌體則來(lái)源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，其大小范圍為40納米至約160納米（平均約100納米）。多年來(lái)，已確定這兩種外泌體分類(lèi)在生理和病理上都發(fā)揮作用。但在過(guò)去十年中，越來(lái)越多的證據(jù)表明，膜囊泡是細(xì)胞間通訊中的重要信使。外泌體是這些囊泡中最被研究和特征明確的。外泌體通過(guò)質(zhì)膜的雙重內(nèi)陷形成。首先，內(nèi)陷形成一個(gè)杯狀結(jié)構(gòu)，從早期分選內(nèi)質(zhì)體（ESEs）開(kāi)始，它們通過(guò)跨高爾基體網(wǎng)絡(luò)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的貢獻(xiàn)成熟為晚期分選內(nèi)質(zhì)體（LSEs），隨后，內(nèi)質(zhì)膜的內(nèi)陷形成含有腔內(nèi)囊泡（ILVs，未來(lái)的外泌體）的多囊泡體（MVBs）。最終，外泌體將通過(guò)MVB與質(zhì)膜的融合被釋放（圖1）。由于大小差異、內(nèi)容、細(xì)胞起源和在受體細(xì)胞中的功能，外泌體是異質(zhì)的。它們的大小異質(zhì)性來(lái)自于外泌體內(nèi)容物在MVBs中的不均勻內(nèi)陷。外泌體的內(nèi)容物可能因其功能而異；通常，外泌體具有以下貨物：膜蛋白、細(xì)胞質(zhì)和核蛋白，以及細(xì)胞外基質(zhì)和核酸，如mRNA、非編碼RNA種類(lèi)和DNA。它們對(duì)受體細(xì)胞的作用和影響也可能因細(xì)胞表面受體而異，可以誘導(dǎo)細(xì)胞存活、凋亡和免疫調(diào)節(jié)。關(guān)于外泌體，異質(zhì)性也可以由它們的細(xì)胞起源引起。外泌體的攝取與多種機(jī)制有關(guān)，如依賴于clathrin的內(nèi)吞作用、吞噬作用和微囊泡吞噬作用。外泌體具有多種表面分子，使它們能夠與許多受體細(xì)胞相互作用。這意味著外泌體可以向不同細(xì)胞傳遞多種信號(hào)，或者在細(xì)胞上沒(méi)有生理功能，僅作為營(yíng)養(yǎng)水平的放大器。

圖1 外泌體、微囊泡和凋亡小體是不同類(lèi)型胞外囊泡（EVs），在細(xì)胞間通訊中扮演重要角色。外泌體是通過(guò)內(nèi)膜向內(nèi)出芽形成的小囊泡，而微囊泡是通過(guò)質(zhì)膜向外出芽形成的較大囊泡。凋亡小體是在程序性細(xì)胞死亡過(guò)程中釋放的囊泡。這些EVs攜帶各種分子，并且可以被鄰近細(xì)胞攝取，促進(jìn)通訊和生物材料的轉(zhuǎn)移。

3.外泌體的生物學(xué)功能

如前所述，外泌體具有生理和病理屬性。它們可以攜帶多種分子，包括microRNAs、mRNAs和蛋白質(zhì)。外泌體可以將這些分子傳遞給其他細(xì)胞，這些細(xì)胞隨后可以使用它們來(lái)改變它們的行為。這個(gè)過(guò)程被稱為外泌體介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊。外泌體可以與近鄰的細(xì)胞通訊，也可以通過(guò)血液循環(huán)與身體其他部位的細(xì)胞通訊。外泌體甚至可以通過(guò)血腦屏障，該屏障將血液與大腦分開(kāi)。有報(bào)道稱，外泌體是細(xì)胞間相互通訊的多功能方式。它們可以同時(shí)傳遞多個(gè)信號(hào)，并且可以針對(duì)多個(gè)細(xì)胞和多個(gè)位置。這使得外泌體成為細(xì)胞間通訊的強(qiáng)大工具。外泌體是一個(gè)迅速發(fā)展的研究領(lǐng)域�？茖W(xué)家們?nèi)栽诹私馑鼈兊脑S多功能。然而，很明顯，外泌體在細(xì)胞間通訊和許多其他生物過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)了CAR-T細(xì)胞療法作為第一種基因療法。表達(dá)嵌合抗原受體（CAR）的基因工程T細(xì)胞作為一種有前途的新療法，正在迅速崛起，用于治療血液學(xué)和非血液學(xué)惡性腫瘤。在實(shí)體瘤中，CAR-T療法并未取得在血液學(xué)惡性腫瘤中觀察到的臨床成功�；�于CAR的過(guò)繼免疫療法使用基因修飾的T淋巴細(xì)胞提供腫瘤靶向和免疫反應(yīng)，可以作為活體藥物，對(duì)目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行持續(xù)的細(xì)胞毒性攻擊。CAR-T細(xì)胞及其在體內(nèi)的復(fù)制可以增強(qiáng)細(xì)胞因子釋放，這不容易控制。這種效應(yīng)是潛在的副作用來(lái)源，如CRS（細(xì)胞因子釋放綜合征）、細(xì)胞因子風(fēng)暴和靶向腫瘤外的反應(yīng)。

3.1.實(shí)體瘤癌癥

CAR-T細(xì)胞療法徹底改變了癌癥治療領(lǐng)域，特別是在血液學(xué)惡性腫瘤的管理中。然而，其在實(shí)體瘤中的應(yīng)用由于腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜性，如異質(zhì)性和惡劣的腫瘤微環(huán)境，提出了獨(dú)特的挑戰(zhàn)。在目標(biāo)識(shí)別、增強(qiáng)腫瘤滲透、管理毒性和探索聯(lián)合療法方面的進(jìn)展，為CAR-T細(xì)胞療法在抗擊實(shí)體瘤中的有效使用帶來(lái)了希望，使我們更接近個(gè)性化和精確的癌癥治療。

目標(biāo)選擇確實(shí)是CAR-T細(xì)胞療法在實(shí)體瘤中的一個(gè)重要障礙。實(shí)體瘤組織復(fù)雜的性質(zhì)和不同腫瘤細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達(dá)譜的變異性，使得識(shí)別能夠有效覆蓋所有腫瘤細(xì)胞的目標(biāo)變得具有挑戰(zhàn)性。即使抗原陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞被消除，仍有大量抗原陰性細(xì)胞可能持續(xù)存在，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)率高。

實(shí)體瘤目標(biāo)選擇的困難之一是實(shí)體瘤細(xì)胞源自健康組織。許多在腫瘤細(xì)胞中高度表達(dá)的抗原也在正常細(xì)胞中少量表達(dá)。這在避免非特異性殺傷健康細(xì)胞方面提出了挑戰(zhàn)，導(dǎo)致靶向腫瘤外的副作用。腫瘤異質(zhì)性是CAR-T細(xì)胞療法在實(shí)體瘤中的另一個(gè)重大挑戰(zhàn)。實(shí)體瘤通常表現(xiàn)出高水平的異質(zhì)性，意味著同一患者內(nèi)的不同腫瘤細(xì)胞可能不表達(dá)相同的腫瘤相關(guān)抗原。因此，如果CAR-T細(xì)胞識(shí)別單一目標(biāo)來(lái)治療實(shí)體瘤，療法的成功可能取決于腫瘤的異質(zhì)性。

CD133，一種新的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物，已被確定為在許多實(shí)體瘤中過(guò)表達(dá)的目標(biāo)，并正在作為CAR-T細(xì)胞療法的目標(biāo)進(jìn)行探索。然而，實(shí)體瘤的高度異質(zhì)性使得其治療比血液學(xué)惡性腫瘤更具挑戰(zhàn)性。關(guān)鍵挑戰(zhàn)在于選擇能夠有效解決實(shí)體瘤異質(zhì)性和復(fù)雜性的目標(biāo)。

已觀察到CAR-T細(xì)胞返回淋巴和血液系統(tǒng)，增加了遇到血液腫瘤細(xì)胞的可能性。CAR-T細(xì)胞療法在實(shí)體瘤中的成功取決于其穿透腫瘤組織通過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞的能力。

CAR-T細(xì)胞進(jìn)入實(shí)體瘤的有限遷移和侵襲可以歸因于腫瘤微環(huán)境中存在的密集纖維化基質(zhì)和促進(jìn)T細(xì)胞滲透到腫瘤組織中的趨化因子的下調(diào)。

實(shí)體瘤中惡劣的免疫抑制腫瘤微環(huán)境進(jìn)一步復(fù)雜化了CAR-T細(xì)胞療法。腫瘤微環(huán)境（TME）是一個(gè)復(fù)雜的環(huán)境，由各種細(xì)胞外基質(zhì)、基質(zhì)細(xì)胞、炎癥細(xì)胞和血管組成。在實(shí)體瘤中，TME的特點(diǎn)是血管化低、缺氧和細(xì)胞外基質(zhì)濃度高。有幾個(gè)因素促成了免疫抑制TME，對(duì)CAR-T細(xì)胞療法提出了重大挑戰(zhàn)。實(shí)體瘤通常表現(xiàn)出酸性TME，這是由于增加的糖酵解和乳酸產(chǎn)生。低pH值抑制T細(xì)胞功能，并通過(guò)損害CAR-T細(xì)胞活性和細(xì)胞因子產(chǎn)生促進(jìn)免疫逃逸。

在實(shí)體瘤中，TME的特點(diǎn)是難以獲得色氨酸，這是一種對(duì)T細(xì)胞最佳功能至關(guān)重要的必需氨基酸。腫瘤細(xì)胞和免疫抑制細(xì)胞，如骨髓源性抑制細(xì)胞（MDSCs），可以通過(guò)酶色氨酸2,3-雙加氧酶（IDO）消耗色氨酸，導(dǎo)致T細(xì)胞抑制。實(shí)體瘤通常在TME中有低氧水平（缺氧）區(qū)域。缺氧可以損害CAR-T細(xì)胞的功能和存活，降低其靶向腫瘤細(xì)胞的有效性。TME中的免疫抑制細(xì)胞，如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）、MDSCs和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs），分泌免疫抑制分子如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、白介素-10（IL-10）和程序性細(xì)胞死亡配體1（PD-L1）。這些分子抑制CAR-T細(xì)胞活性，抑制免疫反應(yīng)，并促進(jìn)腫瘤免疫逃逸。

這些因素共同在實(shí)體瘤內(nèi)創(chuàng)造了一個(gè)免疫抑制和惡劣的環(huán)境，阻礙了CAR-T細(xì)胞療法的效力�？朔�這些挑戰(zhàn)是研究的重點(diǎn)，涉及增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞持久性、調(diào)節(jié)TME和將CAR-T療法與其他免疫調(diào)節(jié)方法相結(jié)合的策略，以改善實(shí)體瘤的治療結(jié)果。

3.2.肺癌治療

肺癌確實(shí)是全球最普遍且致死率最高的癌癥之一。不幸的是，大部分肺癌患者在晚期才被診斷出，此時(shí)治療選擇有限，導(dǎo)致5年生存率大約只有10-20%。盡管外科切除結(jié)合輔助治療仍是主要的治療策略，但只有少數(shù)患者符合手術(shù)條件，手術(shù)后的復(fù)發(fā)仍是一個(gè)重大問(wèn)題。因此，迫切需要探索新的治療策略，以阻止腫瘤進(jìn)展并改善肺癌患者的生存結(jié)果。

CAR-T細(xì)胞療法在血液惡性腫瘤中已證明成功，為治療實(shí)體瘤，包括肺癌，提供了新的希望。然而，它面臨著與其他實(shí)體瘤相似的挑戰(zhàn)，如前所述。此外，CAR-T細(xì)胞的臨床應(yīng)用受到腫瘤溶解綜合征、神經(jīng)毒性綜合征和細(xì)胞因子釋放綜合征等挑戰(zhàn)的阻礙。

根據(jù)提供的信息，對(duì)于患有肺癌的患者，有一系列潛在的腫瘤相關(guān)抗原（TAAs）可用于CAR-T細(xì)胞療法。值得注意的是，選擇CAR-T細(xì)胞療法的最佳TAA取決于多種因素，包括腫瘤的特定特征及其微環(huán)境。需要進(jìn)一步的研究和臨床試驗(yàn)來(lái)確定在CAR-T細(xì)胞療法中針對(duì)這些TAAs的療效和安全性：

• 表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）是一種在實(shí)體瘤中經(jīng)常過(guò)表達(dá)的蛋白質(zhì)，包括肺癌和腦轉(zhuǎn)移。EGFRvIII是EGFR的一種變體，在肺癌中尤為常見(jiàn)。針對(duì)EGFRvIII工程化的CAR-T細(xì)胞已被證明能有效殺死EGFRvIII陽(yáng)性的肺癌細(xì)胞。這可能是預(yù)防手術(shù)后肺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的潛在治療策略。
• 間皮素（MSLN）是一種細(xì)胞粘附糖蛋白，與肺癌患者的高腫瘤侵襲性和預(yù)后不良相關(guān)。它被認(rèn)為是包括肺癌在內(nèi)的實(shí)體瘤CAR-T療法的理想靶點(diǎn)。
• 黏蛋白1（MUC1）是一種跨膜蛋白，涉及癌細(xì)胞粘附和轉(zhuǎn)移。與正常肺組織相比，MUC1在肺癌組織中的表達(dá)顯著更高。它是肺癌CAR-T細(xì)胞療法的潛在靶點(diǎn)。
• 人表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER2）在肺癌中高度表達(dá)。它促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、侵襲和血管生成。HER2可以作為肺癌診斷和治療的有希望的生物標(biāo)志物。

3.3.乳腺癌

乳腺癌目前在全球女性癌癥中的發(fā)病率和死亡率最高�，F(xiàn)有治療的耐藥性出現(xiàn)，強(qiáng)調(diào)了開(kāi)發(fā)新療法的必要性。CAR-T細(xì)胞療法是一種利用患者免疫細(xì)胞對(duì)抗癌癥的免疫療法，已顯示出前景，并已廣泛應(yīng)用于血液惡性腫瘤。其在治療實(shí)體瘤，包括乳腺癌中的應(yīng)用勢(shì)頭增強(qiáng)。在乳腺癌細(xì)胞中，已鑒定出表達(dá)改變的特定分子作為CAR-T細(xì)胞療法的潛在靶點(diǎn)。十九種抗原，即HER2、EGFR、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體/間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化因子（HGFR/cMET）、酪氨酸蛋白激酶跨膜受體（ROR1）、AXL受體酪氨酸激酶（AXL）、MUC1、MSLN、CD70、CD133、CD44v6、上皮細(xì)胞粘附分子（EpCAM）、軟骨素硫酸蛋白聚糖4（CSGP4）、細(xì)胞間粘附分子1（ICAM1）、腫瘤內(nèi)皮標(biāo)記8（TEM8）、滋養(yǎng)層細(xì)胞表面抗原2（TROP2）、葉酸受體α（FRα）、自然殺傷組2成員D（NKG2D）、GD2和癌胚抗原（CEA），已作為乳腺癌CAR-T細(xì)胞療法的靶點(diǎn)進(jìn)行研究。這些抗原大多屬于受體酪氨酸激酶家族和細(xì)胞表面蛋白。研究表明，所有19種抗原都顯示出抗腫瘤效應(yīng)，抑制腫瘤生長(zhǎng)并誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的釋放。

盡管近年來(lái)CAR-T細(xì)胞療法取得了進(jìn)展，但仍存在幾項(xiàng)挑戰(zhàn)，包括不充分的轉(zhuǎn)移和滲透、免疫抑制環(huán)境的存在、缺乏腫瘤特異性或腫瘤相關(guān)抗原以及CAR-T細(xì)胞毒性。

盡管CAR-T細(xì)胞療法在乳腺癌方面取得了顯著進(jìn)展，但由于支持證據(jù)不足，其在臨床設(shè)置中的應(yīng)用仍相距甚遠(yuǎn)。為了加快CAR-T細(xì)胞療法在乳腺癌患者中的臨床實(shí)施，外泌體療法和臨床試驗(yàn)對(duì)于解決安全問(wèn)題和克服現(xiàn)有挑戰(zhàn)至關(guān)重要。

3.4.血液學(xué)和非霍奇金淋巴瘤（NHL）治療

CAR-T細(xì)胞免疫療法在治療血液惡性腫瘤方面取得了顯著成功，在臨床試驗(yàn)中觀察到高緩解率。針對(duì)CD19的CAR-T細(xì)胞顯示出對(duì)耐藥性B細(xì)胞惡性腫瘤的持久緩解效果，復(fù)發(fā)和難治性急性B淋巴細(xì)胞性白血病的治愈率已達(dá)到大約80-90%。

CAR-T療法在血液惡性腫瘤，如急性淋巴細(xì)胞性白血病和大B細(xì)胞淋巴瘤中的成功，徹底改變了它們的治療。FDA批準(zhǔn)針對(duì)CD19的CAR-T細(xì)胞用于治療復(fù)發(fā)或難治性兒童和年輕成人彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL），進(jìn)一步驗(yàn)證了這種方法的有效性。

CAR-T細(xì)胞療法在血液惡性腫瘤中的成功關(guān)鍵因素之一是存在單克隆疾病，其中單一靶抗原（如CD19）表達(dá)在所有腫瘤細(xì)胞表面。這使得CAR-T細(xì)胞能夠有效地靶向并消除癌細(xì)胞。為了克服這些挑戰(zhàn)，未來(lái)針對(duì)腫瘤的治療策略可能會(huì)涉及將基于免疫療法的治療，如CAR-T細(xì)胞療法，與其他治療方式相結(jié)合。

非霍奇金淋巴瘤（NHL）美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）最近批準(zhǔn)的CD19特異性CAR-T細(xì)胞療法為化療耐藥性B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤（NHL）和復(fù)發(fā)/難治性兒童及年輕成人彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）提供了有希望的治療。CD19是一個(gè)泛B細(xì)胞標(biāo)記，在大多數(shù)B細(xì)胞NHL中高度表達(dá)，使其成為這些惡性腫瘤中CAR-T細(xì)胞療法的合適靶點(diǎn)。在急性淋巴細(xì)胞性白血病（ALL）的情況下，針對(duì)CD19的CAR-T細(xì)胞的臨床效果似乎比淋巴瘤更顯著。這可能是由于疾病生物學(xué)和治療反應(yīng)的差異。另一方面，外周T細(xì)胞淋巴瘤患者呈現(xiàn)一組異質(zhì)性疾病，通常預(yù)后較差，這對(duì)CAR-T細(xì)胞療法構(gòu)成了挑戰(zhàn)。

CAR-T細(xì)胞療法已從第一代發(fā)展到第二代CAR-T細(xì)胞。第一代CAR-T細(xì)胞使用CD3z鏈作為信號(hào)域，而第二代CAR-T細(xì)胞增加了額外的共刺激域以增強(qiáng)其抗腫瘤活性。第二代CAR-T細(xì)胞療法顯示出更顯著的抗白血病反應(yīng)，在復(fù)發(fā)B細(xì)胞ALL患者中高恢復(fù)率達(dá)到90%。然而，在具有高風(fēng)險(xiǎn)特征的個(gè)體中，如早期復(fù)發(fā)、難治性疾病和某些類(lèi)型的淋巴瘤，治療結(jié)果仍然不佳。

目前，針對(duì)CD19的CAR-T細(xì)胞在約40%的化療耐藥性DLBCL、高級(jí)別B細(xì)胞淋巴瘤（HGBCL）和未經(jīng)前期治療的原發(fā)性縱隔B細(xì)胞淋巴瘤（PMBCL）患者中顯示出持續(xù)的緩解率。這些產(chǎn)品也用于至少經(jīng)過(guò)兩線前期治療后復(fù)發(fā)的侵襲性淋巴瘤患者。CAR-T細(xì)胞療法的進(jìn)步為治療NHL患者提供了高效的解決方案。

3.5.前列腺癌

盡管在轉(zhuǎn)移性前列腺癌（mPCa）中使用CAR-T細(xì)胞療法的研究有限，但已對(duì)這種情況下CAR-T細(xì)胞療法的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行了研究。兩個(gè)重要的CAR-T細(xì)胞靶向抗原候選者是前列腺特異性膜抗原（PSMA）和前列腺干細(xì)胞抗原（PSCA）。體外和體內(nèi)模型表明PSMA-CAR-T細(xì)胞可以增殖并識(shí)別PSMA陽(yáng)性細(xì)胞。第二代CAR-T細(xì)胞顯示出比前幾代更好的殺傷效果，代表了mPCa的一種新的免疫靶向方法。

在前列腺癌（PCa）中，已確定幾種蛋白質(zhì)由惡性細(xì)胞優(yōu)先表達(dá)，包括前列腺特異性抗原（PSA）、前列腺酸性磷酸酶（PAP）、前列腺干細(xì)胞抗原（PSCA）、T細(xì)胞受體γ替代閱讀框蛋白（TARP）、瞬時(shí)受體電位（trp）-p8和前列腺特異性膜抗原（PSMA）。最近，各種研究探索了這些前列腺腫瘤相關(guān)抗原（TAAs）作為在PCa患者中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的靶點(diǎn)。

總的來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)移性前列腺癌中CAR-T細(xì)胞療法的使用是一個(gè)積極研究的領(lǐng)域，雖然已經(jīng)獲得了有希望的臨床前結(jié)果，但需要進(jìn)一步調(diào)查以評(píng)估這種方法在臨床設(shè)置中的安全性和有效性。

3.6.膠質(zhì)母細(xì)胞瘤

外泌體的使用為CAR-T細(xì)胞技術(shù)在實(shí)體瘤治療中的應(yīng)用，包括針對(duì)特定區(qū)域的腫瘤，如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM），帶來(lái)了希望。雖然CAR-T細(xì)胞療法在GBM中的探索還處于早期階段，但初步結(jié)果已經(jīng)顯示出使用這種方法的可行性、安全性甚至療效跡象。

在CAR-T細(xì)胞療法進(jìn)一步開(kāi)發(fā)用于GBM時(shí)，需要解決的幾個(gè)挑戰(zhàn)包括增強(qiáng)CAR T細(xì)胞對(duì)腫瘤的滲透、優(yōu)化輸注劑量和頻率、調(diào)節(jié)免疫抑制性腫瘤微環(huán)境，以及解決GBM固有的分子異質(zhì)性。此外，與GBM的免疫療法相關(guān)的一般挑戰(zhàn)，如管理合并類(lèi)固醇使用、區(qū)分真正的腫瘤進(jìn)展與放射影像假進(jìn)展，以及識(shí)別潛在的反應(yīng)生物標(biāo)志物，需要在任何CAR-T細(xì)胞研究中考慮和解決。GBM的初始CAR靶標(biāo)，如IL-13 Rα2、EGFRvIII和HER2，只是正在探索用于該疾病CAR靶向的潛在抗原的一些例子。針對(duì)ephrin-A2和EGFR的CAR-T細(xì)胞的臨床調(diào)查正在進(jìn)行中，最近發(fā)現(xiàn)了新的抗原，如CD70。這些研究和其他研究的結(jié)果備受期待，以進(jìn)一步推進(jìn)我們對(duì)GBM CAR-T細(xì)胞療法的理解。

總之，盡管存在需要克服的挑戰(zhàn)，但早期結(jié)果已經(jīng)顯示出CAR-T細(xì)胞療法在GBM中的前景。正在進(jìn)行的臨床調(diào)查和探索新的抗原作為CAR靶點(diǎn)為這一具有挑戰(zhàn)性的疾病提供了改善療法的希望。

3.7.CAR-T細(xì)胞和溶瘤病毒治療

CAR-T細(xì)胞和溶瘤病毒（OVs）已顯示出針對(duì)血液和實(shí)體腫瘤的潛力。然而，作為單一療法，它們的效果有限，特別是在實(shí)體腫瘤的情況下。為了應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn)，癌癥基因治療領(lǐng)域一直在專(zhuān)注于開(kāi)發(fā)包括化療、放療和其他免疫療法（如免疫檢查點(diǎn)抑制劑ICIs）在內(nèi)的聯(lián)合治療策略。

將CAR-T細(xì)胞和OVs結(jié)合起來(lái)可能改善各種類(lèi)型癌癥患者的治療結(jié)果。通過(guò)整合兩種方法的優(yōu)勢(shì)，有潛力增強(qiáng)腫瘤靶向、免疫激活和治療效果。然而，需要進(jìn)一步的研究和臨床試驗(yàn)來(lái)評(píng)估這些聯(lián)合策略在更廣泛的癌癥類(lèi)型和患者群體中的安全性、可行性和有效性。

3.8.CAR-T細(xì)胞療法的局限性

確實(shí)，為了充分發(fā)揮CAR-T細(xì)胞療法的潛力，需要解決幾個(gè)挑戰(zhàn)。其中一些挑戰(zhàn)包括理解腫瘤微環(huán)境。宿主腫瘤微環(huán)境在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，可能影響CAR-T細(xì)胞療法的效果。另一個(gè)挑戰(zhàn)是擴(kuò)大CAR-T療法的適用性，因?yàn)樾枰�使CAR-T療法可用于治療更廣泛的人類(lèi)癌癥。這涉及識(shí)別和測(cè)試新抗原以及優(yōu)化CAR設(shè)計(jì)以針對(duì)特定類(lèi)型的癌癥。此外，CAR-T療法目前成本高昂，對(duì)許多患者來(lái)說(shuō)可能負(fù)擔(dān)不起。解決CAR-T細(xì)胞療法的定價(jià)和可負(fù)擔(dān)性問(wèn)題是確保更廣泛獲取和可用性的關(guān)鍵。管理副作用是另一個(gè)問(wèn)題；CAR-T細(xì)胞療法可能與副作用相關(guān)，如CRS、高燒、竇性心動(dòng)過(guò)速、低血壓、低氧、神經(jīng)毒性、心臟功能抑制、其他器官功能障礙和移植物抗宿主�。℅VHD）。需要開(kāi)發(fā)管理這些副作用的策略以提高患者安全和治療效果。

CAR-T細(xì)胞可能會(huì)經(jīng)歷耗竭和衰老，導(dǎo)致功能減弱和療效降低。理解和解決T細(xì)胞耗竭對(duì)于最大化CAR-T細(xì)胞療法的長(zhǎng)期效果至關(guān)重要。

增強(qiáng)對(duì)免疫檢查點(diǎn)阻斷的反應(yīng)在癌癥治療中很重要。耗竭的T細(xì)胞可能會(huì)抑制效應(yīng)免疫并降低對(duì)免疫檢查點(diǎn)阻斷療法的反應(yīng)性。檢查點(diǎn)阻斷療法通過(guò)靶向調(diào)節(jié)T細(xì)胞反應(yīng)的免疫檢查點(diǎn)，在癌癥治療中取得了重大突破。一項(xiàng)研究探討了免疫檢查點(diǎn)阻斷的重要性以及耗竭T細(xì)胞在抑制效應(yīng)T細(xì)胞中的作用。這項(xiàng)研究重點(diǎn)關(guān)注了耗竭T細(xì)胞、針對(duì)程序性細(xì)胞死亡蛋白1（PD-1）的免疫檢查點(diǎn)阻斷和激進(jìn)癌癥干細(xì)胞（CSCs）的產(chǎn)生和維持之間的關(guān)系。CSCs是腫瘤內(nèi)具有自我更新和腫瘤啟動(dòng)能力的一小部分細(xì)胞，有助于腫瘤生長(zhǎng)和治療抵抗。作者證明，對(duì)PD-1阻斷無(wú)反應(yīng)的終末耗竭CD8+T細(xì)胞在促進(jìn)激進(jìn)CSCs的產(chǎn)生和維持中扮演了重要角色。他們發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境中耗竭CD8+T細(xì)胞的存在導(dǎo)致CSCs上免疫檢查點(diǎn)分子（如PD-L1）的表達(dá)增加。這種耗竭T細(xì)胞和CSCs之間的相互作用導(dǎo)致效應(yīng)T細(xì)胞活性的抑制和增強(qiáng)CSC干細(xì)胞特性。

需要探索克服T細(xì)胞耗竭和增強(qiáng)對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑反應(yīng)的策略，以改善聯(lián)合療法的結(jié)果。

應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn)將需要科學(xué)家、臨床醫(yī)生和行業(yè)合作伙伴之間的持續(xù)研究、創(chuàng)新和合作。盡管存在這些挑戰(zhàn)，對(duì)CAR-T細(xì)胞療法的日益增長(zhǎng)的知識(shí)提供了寶貴的見(jiàn)解，可以指導(dǎo)該領(lǐng)域的進(jìn)一步改進(jìn)和進(jìn)步。

4.CAR-T細(xì)胞衍生的外泌體的優(yōu)勢(shì)

CAR-T細(xì)胞療法存在局限性，包括強(qiáng)烈的毒性、抗原逃逸和腫瘤浸潤(rùn)的限制。然而，CAR-T細(xì)胞衍生的外泌體（EVs）提供了一種更安全且潛在有效的免疫療法選擇，在癌癥研究中引起了興趣。這些外泌體可以定制攜帶各種貨物，如針對(duì)腫瘤的受體、小干擾RNA（siRNAs）或細(xì)胞因子，這些物質(zhì)增強(qiáng)了抗癌效果。CAR T細(xì)胞衍生的細(xì)胞外囊泡（EVs）的顯著益處包括安全性（無(wú)細(xì)胞性質(zhì)）、易于修改、可檢測(cè)性和癌癥的特異性。以下段落將進(jìn)一步解釋這一點(diǎn)，并在表1中描述。

4.1.更可控的條件

與輸注CAR表達(dá)T細(xì)胞相關(guān)的最嚴(yán)重的副作用之一是CAR-T細(xì)胞誘導(dǎo)的CRS。CRS的癥狀包括惡心、頭痛、心動(dòng)過(guò)速、低血壓、皮疹和呼吸急促。這些癥狀是由免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子引起的。細(xì)胞因子風(fēng)暴是一種嚴(yán)重的CRS，經(jīng)常導(dǎo)致低血壓和高燒，最終可能導(dǎo)致器官衰竭甚至死亡。幾乎三分之二的CAR-T細(xì)胞患者經(jīng)歷了CRS，通常出現(xiàn)在細(xì)胞輸注后10天。在最初的CAR-T細(xì)胞臨床試驗(yàn)中，有兩例報(bào)告的死亡。這種潛在致命的后果主要與CAR-T細(xì)胞不受控制的細(xì)胞因子分泌有關(guān)。首先，由大量輸注的抗腫瘤淋巴細(xì)胞（高達(dá)10^11）釋放的細(xì)胞因子引起的全身性炎癥反應(yīng)類(lèi)似于膿毒癥。如果細(xì)胞因子風(fēng)暴導(dǎo)致心律失常、心臟驟停、肝衰竭或腎衰竭，接受者的生命可能處于危險(xiǎn)之中。其次，CAR-T細(xì)胞可能會(huì)失控?cái)U(kuò)張，并表現(xiàn)為“活性藥物”，導(dǎo)致CRS。第二代和第三代CAR結(jié)構(gòu)中成本刺激受體如CD28、4-1BB、DPA10、OX40或ICOS的作用顯著提高了反復(fù)抗原暴露后的絕對(duì)T細(xì)胞增殖。例如，在慢性淋巴細(xì)胞性白血病患者中，4-1BB整合的CD19 CAR-T細(xì)胞在給藥后可以增殖超過(guò)1000倍。CAR-T細(xì)胞的體內(nèi)擴(kuò)張被認(rèn)為是必不可少的，并且與毒性和反應(yīng)有關(guān)。在重癥監(jiān)護(hù)室中，類(lèi)固醇、升壓藥和IL-6阻斷劑以及支持性治療都已成功用于解決CRS相關(guān)問(wèn)題。與傳統(tǒng)藥物引起的副作用不同，CAR-T細(xì)胞引起的毒性不能僅通過(guò)減少藥物劑量來(lái)控制。研究人員嘗試在CAR中加入自殺基因作為安全開(kāi)關(guān)，以在極度毒性的情況下消除CAR-T細(xì)胞。這種策略涉及工程化CAR-T細(xì)胞，使其具有自殺基因，當(dāng)出現(xiàn)不良反應(yīng)時(shí)可以激活以誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。包括這個(gè)安全開(kāi)關(guān)，允許及時(shí)和控制性地消除CAR-T細(xì)胞，最小化對(duì)患者的潛在傷害。CAR-T細(xì)胞衍生的外泌體有潛力被用作對(duì)癌細(xì)胞的直接攻擊，使這些“活性藥物”更容易控制。這是因?yàn)橥饷隗w具有與CAR-T細(xì)胞相同的生物學(xué)特性。CAR-T細(xì)胞衍生的外泌體可以通過(guò)直接攻擊腫瘤來(lái)控制CAR-T細(xì)胞誘導(dǎo)的毒性，并取代對(duì)免疫細(xì)胞的需求（圖2）。Zitvogel及其同事的初步研究提供了這一理論。在他們的體內(nèi)研究中，用腫瘤肽脈沖的小鼠DC產(chǎn)生的外泌體導(dǎo)致了現(xiàn)有腫瘤的排斥。體外，DC產(chǎn)生的外泌體在誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)方面與具有相似數(shù)量的DCs（0.5×10^6至1×10^6 DCs）的細(xì)胞一樣有效。Peters等人的早期研究表明，人類(lèi)T細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體在細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）與其靶細(xì)胞之間的相互作用中至關(guān)重要。CTL的表面膜分子，如T細(xì)胞受體（TCR）、CD3和CD8，存在于CTL衍生的外泌體中。這些分子允許外泌體特異性地靶向和殺死腫瘤細(xì)胞。當(dāng)外泌體與腫瘤細(xì)胞結(jié)合時(shí)，外泌體上的TCR與腫瘤細(xì)胞的抗原/MHC復(fù)合物相互作用。這種相互作用觸發(fā)了外泌體與腫瘤細(xì)胞之間的共軛形成。然后共軛對(duì)外泌體和腫瘤細(xì)胞傳遞致命一擊，導(dǎo)致其死亡。外泌體對(duì)外泌體靶向的腫瘤細(xì)胞傳遞的致命一擊是由蛋白質(zhì)和其他分子的釋放引起的，包括穿孔素、顆粒酶和溶酶體酶。TCR激活刺激了CTL衍生的外泌體的產(chǎn)生，類(lèi)似的工作已經(jīng)證明TCR/CD3復(fù)合物存在于人類(lèi)CTL衍生的外泌體的膜中。

圖2 A. 腫瘤微環(huán)境（TME）以有限的血管形成、低氧水平（缺氧）和豐富的細(xì)胞外基質(zhì)成分為特征。缺氧可能會(huì)損害CAR-T細(xì)胞的功能和存活，降低其靶向腫瘤細(xì)胞的有效性。B. 一旦識(shí)別到腫瘤抗原，CAR T細(xì)胞通過(guò)釋放炎癥細(xì)胞因子啟動(dòng)免疫反應(yīng)。這觸發(fā)免疫細(xì)胞產(chǎn)生大量細(xì)胞因子，導(dǎo)致一種稱為細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）的狀況。CRS主要是由激活的免疫細(xì)胞（包括T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞（MQ）、B細(xì)胞、單核細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞（DC））釋放的眾多炎癥因子引起的全身性炎癥反應(yīng)。CRS的臨床表現(xiàn)包括發(fā)熱和多個(gè)器官功能障礙。C. 外泌體與CAR-T細(xì)胞共享相似的特性，使它們成為控制CAR-T細(xì)胞誘導(dǎo)的毒性的潛在工具，通過(guò)直接靶向腫瘤并可能取代免疫細(xì)胞的需求。這些外泌體包含在T細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的表面膜分子，如T細(xì)胞受體（TCR）和CD8，使它們能夠選擇性地靶向并消除腫瘤細(xì)胞。外泌體與腫瘤細(xì)胞結(jié)合時(shí)，外泌體上的TCR與腫瘤細(xì)胞的抗原/MHC復(fù)合體相互作用，導(dǎo)致外泌體與腫瘤細(xì)胞之間形成共軛。這種共軛對(duì)外泌體和腫瘤細(xì)胞造成致命打擊，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。

與CAR-T細(xì)胞相比，CAR-T EVs和外泌體顯示出更低的毒性潛力。這使它們適合作為無(wú)細(xì)胞免疫療法劑，這可能簡(jiǎn)化了監(jiān)管批準(zhǔn)，因?yàn)樗鼈兛赡懿槐粴w類(lèi)為先進(jìn)治療藥物產(chǎn)品。此外，CAR-T外泌體具有低免疫原性，允許它們?cè)诘谌�方環(huán)境中作為現(xiàn)成產(chǎn)品使用。與親代細(xì)胞不同，EVs和外泌體可以輕松穿透腫瘤屏障，即使是在具有顯著纖維反應(yīng)的腫瘤中。研究表明，通過(guò)刺激生產(chǎn)細(xì)胞可以提高EV的產(chǎn)生和功能。在自體CAR生產(chǎn)中使用CAR-T EV療法消除了將腫瘤細(xì)胞重新引入患者的風(fēng)險(xiǎn)，這是CAR-T細(xì)胞療法的一個(gè)擔(dān)憂。已經(jīng)觀察到，殘留的腫瘤細(xì)胞可能無(wú)意中獲得CAR表達(dá)，導(dǎo)致對(duì)CAR-T細(xì)胞療法產(chǎn)生抗藥性。來(lái)自T淋巴細(xì)胞的EVs表達(dá)TCR和促凋亡分子，賦予它們細(xì)胞毒性和抗原特異性。這表明CAR-T細(xì)胞衍生的EVs可以有效傳遞促凋亡信號(hào)到癌細(xì)胞。然而，CAR分子在CAR-T細(xì)胞衍生的EVs上的存在對(duì)于誘導(dǎo)特定的癌細(xì)胞死亡至關(guān)重要，類(lèi)似于它們的親代CAR-T細(xì)胞。通過(guò)優(yōu)化外泌體的釋放和表面CAR的表達(dá)，可以提高CAR表達(dá)外泌體的產(chǎn)生。TCR激活已被證明可以增加CTL衍生的外泌體的產(chǎn)生。另一方面，通過(guò)各種抗原刺激技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)外泌體上更高水平的CAR表達(dá)。這些包括使用涂有重組CAR靶抗原的細(xì)胞珠或使用表達(dá)CAR抗原的細(xì)胞。這些策略可以幫助提高CAR表達(dá)外泌體產(chǎn)生的效果和效率。

盡管對(duì)CAR-T細(xì)胞衍生的外泌體的全面理解仍在研究中，但它們極有可能將抗原靶向的細(xì)胞毒性傳遞給癌細(xì)胞。這是因?yàn)樗鼈儽砻婧�有可以與癌細(xì)胞結(jié)合的靶向分子，以及可以殺死癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性分子。

4.2.直接攻擊者

CAR-T細(xì)胞療法在治療實(shí)體瘤方面的效果不如淋巴惡性腫瘤。多種癌癥的腫瘤微環(huán)境可能會(huì)干擾CAR-T細(xì)胞的抗癌功能，除了用于CAR構(gòu)建的腫瘤抗原的特異性。CAR-T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間的細(xì)胞間相互作用是這種抗癌方法的關(guān)鍵需求。然而，實(shí)體瘤具有豐富的基質(zhì)，CAR-T細(xì)胞必須穿透，這與淋巴惡性腫瘤不同。至少有兩種方式，實(shí)體瘤微環(huán)境限制了CAR-T細(xì)胞的有效性。首先，CAR-T細(xì)胞的功能可能受到腫瘤介導(dǎo)的免疫抑制的限制。腫瘤微環(huán)境通過(guò)影響CAR-T細(xì)胞的體外操作后的T淋巴細(xì)胞功能，從而干擾CAR-T細(xì)胞的效力的第二種機(jī)制。這可能使它們難以穿透實(shí)體瘤的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）。Caruana等人提供了支持上述機(jī)制的直接證據(jù)。ECM的主要成分，肝素硫酸蛋白聚糖，被酶肝素酶（HPSE）降解，該酶被設(shè)計(jì)為在CAR-T細(xì)胞上表達(dá)。HPSE CAR-T細(xì)胞減少ECM的能力被證明有助于腫瘤T細(xì)胞浸潤(rùn)，并最終提高抗癌效力。然而，由于它們的納米級(jí)大小，CAR-T細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體可以用作直接的癌癥吸引劑，這可能有助于CAR介導(dǎo)的抗癌療法。從CAR-T細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體必須能夠作為直接攻擊者，并且能夠針對(duì)特定的抗原靶向腫瘤位置，以替代抗癌療法中的CAR-T細(xì)胞。與需要治療性細(xì)胞主動(dòng)移動(dòng)到目標(biāo)部位的基于細(xì)胞的療法不同，無(wú)細(xì)胞外泌體可以通過(guò)生物液體如血液循環(huán)傳遞。外泌體能夠穿越生物屏障，包括腫瘤血液屏障（BTB）和血腦屏障（BBB）。這一事實(shí)得到了支持，即在體液中發(fā)現(xiàn)了源自腫瘤細(xì)胞的外泌體。此外，靜脈注射的外泌體被腫瘤的高度保留效應(yīng)和滲漏的血管系統(tǒng)推向腫瘤。據(jù)報(bào)道，外泌體在體內(nèi)被動(dòng)傳輸，但它們的目標(biāo)導(dǎo)向分布主要受其表面組織特異性受體的影響，這些受體源自親代細(xì)胞。外泌體可以通過(guò)將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到目標(biāo)細(xì)胞來(lái)殺死癌細(xì)胞。這可以通過(guò)三種不同的機(jī)制發(fā)生。首先，通過(guò)直接接觸，外泌體可以與目標(biāo)細(xì)胞表面的特定受體結(jié)合，觸發(fā)促進(jìn)細(xì)胞死亡的信號(hào)級(jí)聯(lián)。這種相互作用可以激活誘導(dǎo)凋亡的途徑或刺激針對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)。其次，外泌體可以與目標(biāo)細(xì)胞的質(zhì)膜融合，導(dǎo)致生物活性分子（如蛋白質(zhì)和核酸）轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中。這些轉(zhuǎn)移的組分可以破壞細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，啟動(dòng)凋亡途徑或干擾關(guān)鍵的細(xì)胞過(guò)程。最后，外泌體可以通過(guò)內(nèi)吞作用被目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)化，允許其貨物釋放到細(xì)胞內(nèi)空間。外泌體的內(nèi)容物，包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸，然后可以發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，觸發(fā)程序性細(xì)胞死亡或調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。這三種機(jī)制共同展示了外泌體如何有效地介導(dǎo)殺死腫瘤細(xì)胞并促進(jìn)抗癌反應(yīng)。

4.3.靶向特異性

CAR結(jié)構(gòu)中的抗體衍生的單鏈可變片段（scFv）控制CAR-T細(xì)胞的靶向特異性。靶向攻擊屬性依賴于CD19特異性scFv在使用CD19-CAR-T細(xì)胞治療CD19陽(yáng)性血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療方法中。正常器官或組織中也表達(dá)相同的抗原，這就是所謂的“靶向腫瘤外”的影響。細(xì)胞膜蛋白，如參與細(xì)胞靶向的蛋白，可能在生物發(fā)生過(guò)程中被運(yùn)輸?shù)酵饷隗w。根據(jù)Muntasell等人的研究，在24小時(shí)內(nèi)，B細(xì)胞表面結(jié)合的肽-MHC II復(fù)合物中有12%被內(nèi)吞、運(yùn)輸?shù)蕉嗯蒹w，并在外泌體上釋放。

親代細(xì)胞的外泌體很可能能夠傳遞靶向特性。許多臨床前研究支持了這一觀點(diǎn)，盡管對(duì)CAR-T細(xì)胞制造的外泌體還需要更多的研究。Alvarez-Erviti等人在他們的研究中提供了針對(duì)性外泌體的直接證據(jù)。他們通過(guò)基因修飾樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)Lamp2b，這是一種與神經(jīng)元特異性狂犬病病毒糖蛋白（RVG）肽段相關(guān)的外泌體膜蛋白，成功制備了針對(duì)小鼠大腦的外泌體。然后他們使用這些外泌體作為向大腦輸送siRNA的遞送系統(tǒng)。RVG的可用性，作為一種配體，精確地與神經(jīng)元中的乙酰膽堿受體結(jié)合，決定了它們?cè)谙到y(tǒng)遞送后如何精確地分布到神經(jīng)元。由于間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）對(duì)原發(fā)和轉(zhuǎn)移腫瘤部位的偏好，MSC介導(dǎo)的抗癌方法成為廣泛研究的主題。與細(xì)胞對(duì)應(yīng)物相比，CAR-T外泌體提供了幾個(gè)有希望的優(yōu)勢(shì)，包括高靶向特異性、對(duì)PD-L1免疫抑制不敏感，以及降低誘發(fā)細(xì)胞因子釋放綜合征的風(fēng)險(xiǎn)。來(lái)自靶向間皮素（MSLN）的CAR-T細(xì)胞的外泌體也觀察到了類(lèi)似的鼓舞人心的結(jié)果。這些外泌體通過(guò)分泌穿孔素和顆粒酶B，有效地靶向MSLN陽(yáng)性和三陰性乳腺癌細(xì)胞，展示了它們的效率。重要的是，在BT-549和MDA231-MSLN異種移植乳腺癌腫瘤模型中進(jìn)行的體內(nèi)研究表明，具有低毒性的顯著抗腫瘤效果。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了CAR-T外泌體作為一種有前途的癌癥治療方法的潛力。

腫瘤衍生的生物因子和MSCs中匹配受體的存在是MSCs能夠進(jìn)行腫瘤定向歸巢的必要條件。腫瘤通常被描述為“永不愈合的傷口”，因?yàn)樗鼈兪羌?xì)胞因子、趨化因子和其他炎癥介質(zhì)的持續(xù)來(lái)源。然而，MSCs表達(dá)多種生長(zhǎng)因子的受體，如PDGF和IGF-1，以及趨化因子受體，包括CCR2、CCR3、CCR4和CCL5[101]。值得注意的是，所有表面標(biāo)志物、信號(hào)分子和細(xì)胞粘附分子也存在于MSC衍生的外泌體中，這表明外泌體可能采用親代細(xì)胞的歸巢模式，并獲得與其親代細(xì)胞相同的一系列表面受體和相關(guān)結(jié)合蛋白。

這種天然的趨向性表明，選擇理想的細(xì)胞來(lái)源進(jìn)行器官特異性治療方法的外泌體衍生是至關(guān)重要的。然而，工程化的CARs可以提供非HLA限制的細(xì)胞表面成分識(shí)別，并不依賴于HLA進(jìn)行抗原處理和呈遞。因此，CAR-T更廣泛地適用于具有多樣化HLA的患者群體。

4.4.適應(yīng)癌癥的復(fù)雜性和變化

除了賦予CAR-T細(xì)胞抗原特異性靶向能力外，工程化的CARs還增強(qiáng)了CAR-T細(xì)胞的生長(zhǎng)和細(xì)胞因子產(chǎn)生。細(xì)胞因子是最直接的攻擊者，在CAR-T細(xì)胞內(nèi)（主要是白細(xì)胞介素，如IL-2、IL-7、IL-15或IL-21）顯著擴(kuò)大。然而，由于癌組織極度異質(zhì)，癌細(xì)胞高度適應(yīng)，這是藥物抗性的基礎(chǔ)，沒(méi)有特定的攻擊者或藥物能夠有效治療任何特定的癌癥。在藥物治療開(kāi)始之前，幾乎所有癌癥病例中近50%存在對(duì)化療的內(nèi)在抗性，而在剩余的50%癌癥病例中，獲得性抗性發(fā)生在相當(dāng)一部分中。由于癌細(xì)胞的巨大異質(zhì)性和復(fù)雜生物學(xué)特性，表現(xiàn)出廣泛的個(gè)體變異，迄今為止所有克服化療抗性的嘗試都失敗了。這可能是CD19-CAR-T細(xì)胞療法在CD19+B細(xì)胞白血病患者中成功有限的原因。理想的抗癌策略應(yīng)該是多樣化的，并能夠同時(shí)采取行動(dòng)，考慮到癌癥的異質(zhì)性和可變性�？拱┧幬镆部梢愿鶕�(jù)患者的獨(dú)特情況進(jìn)行調(diào)整。事實(shí)上，CAR-T細(xì)胞和CAR-T細(xì)胞衍生的外泌體提供了執(zhí)行上述修改的有利平臺(tái)。

通過(guò)CAR-T細(xì)胞，可以間接添加額外的抗癌藥物。外泌體通過(guò)從親代細(xì)胞向受體細(xì)胞運(yùn)輸各種信息，包括蛋白質(zhì)、mRNAs、ncRNAs和miRNAs，作為細(xì)胞間通信的手段。外泌體和親代細(xì)胞都含有絕大多數(shù)的蛋白質(zhì)、mRNAs和miRNAs。細(xì)胞外蛋白酶和RNases防止外泌體攜帶的蛋白質(zhì)和RNAs降解，延長(zhǎng)它們的半衰期，并增強(qiáng)它們的生物活性。根據(jù)小鼠的臨床前研究，從用腫瘤肽脈沖的DCs中分離出的外泌體能夠在體內(nèi)啟動(dòng)特定的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，并以T細(xì)胞依賴的方式抑制已建立的小鼠腫瘤的生長(zhǎng)，展示了從親代細(xì)胞到外泌體的刺激誘導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)移的操縱。以前已經(jīng)顯示，當(dāng)HepG2（肝癌細(xì)胞）和ASPC-1（胰腺癌細(xì)胞）暴露于用抗癌基因TRAIL工程化的MSCs的條件培養(yǎng)基（CM）時(shí)，它們具有顯著的細(xì)胞毒性。

由MSCs產(chǎn)生的外泌體可能在將抗癌劑從MSCs運(yùn)輸?shù)桨┘?xì)胞中起著至關(guān)重要的作用。因?yàn)門(mén)RAIL表達(dá)載體被用于這種抗癌基因工程，TRAIL通過(guò)外泌體的遞送可能以cDNA、mRNA或蛋白質(zhì)的形式進(jìn)行。研究表明，使用心肌梗死模型，體外培養(yǎng)的基因修飾MSCs的CM在預(yù)防心室重塑方面的效果與細(xì)胞移植相當(dāng)。一個(gè)或多個(gè)癌細(xì)胞攻擊者可能在體外擴(kuò)增的CAR-T細(xì)胞中外泌體的生物合成過(guò)程中被間接加載。之后，根據(jù)患者的治療情況，可以替換多個(gè)和額外的攻擊者，當(dāng)與內(nèi)在的T淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子結(jié)合時(shí)。

此外，抗癌藥物可以直接裝載到由CAR-T細(xì)胞制成的外泌體中。外泌體可能包含親水性和疏水性物質(zhì)，因?yàn)樗鼈冾?lèi)似于脂質(zhì)體，也具有水核心和雙脂膜。對(duì)于像mRNA、siRNA和miRNA這樣的親水性分子，可以通過(guò)短暫的物理（例如，電穿孔）或化學(xué)（例如，脂質(zhì)體介導(dǎo)）破壞外泌體膜來(lái)實(shí)現(xiàn)外泌體裝載。在Alvarez-Erviti等人的研究中，通過(guò)電穿孔將外源siRNA直接裝載到樹(shù)突狀細(xì)胞衍生的外泌體中，這導(dǎo)致了目標(biāo)細(xì)胞中目標(biāo)基因的mRNA和蛋白表達(dá)顯著下調(diào)。然而，短暫的直接共孵育可以使外泌體裝載疏水性分子。

通過(guò)外泌體傳遞的抗癌基因產(chǎn)物更容易使用，因?yàn)樗鼈兂洚?dāng)納米載體。P53、Myc和磷酸酶及張力蛋白同源物（PTEN）是大多數(shù)抗癌基因產(chǎn)物影響腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)機(jī)制的例子。在間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）介導(dǎo)的基因治療領(lǐng)域，MSC被用作傳遞抗癌基因的載體。細(xì)胞內(nèi)的抗癌基因產(chǎn)物需要在MSC中產(chǎn)生并分泌到細(xì)胞外空間，然后它們需要穿透附近的腫瘤細(xì)胞，通過(guò)生物膜，這是大多數(shù)大分子的自然屏障，包括肽和蛋白質(zhì)。因此，相關(guān)表達(dá)載體的構(gòu)建通常包含一個(gè)前導(dǎo)序列和一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活因子（TAT）。然而，外泌體已被證明可以穿過(guò)血漿膜以將貨物傳遞給受體細(xì)胞。例如，來(lái)自樹(shù)突狀細(xì)胞的外泌體可以將裝載有肽段的MHC I和II復(fù)合體傳遞給其他樹(shù)突狀細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞以控制免疫反應(yīng)。來(lái)自親本細(xì)胞的mRNA和蛋白質(zhì)可以直接轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，避免了生物膜。從理論上講，通過(guò)外泌體生物發(fā)生，基因工程化的MSC可以以所有可能的形式傳遞抗癌基因產(chǎn)物，包括cDNA、mRNA和蛋白質(zhì)。這可能解釋了分泌TRAIL和非分泌TRAIL的工程化MSC誘導(dǎo)的癌細(xì)胞死亡之間缺乏區(qū)別。顯然，外泌體將擴(kuò)展和改善基于細(xì)胞的基因治療在癌癥治療中的應(yīng)用，正確應(yīng)用的話。CAR T細(xì)胞衍生的外泌體對(duì)腫瘤細(xì)胞的一些治療潛力在表2中總結(jié)。

5.結(jié)論

利用經(jīng)過(guò)基因改造表達(dá)CAR的T淋巴細(xì)胞，基于CAR的過(guò)繼性免疫療法可以引發(fā)既是T細(xì)胞介導(dǎo)的，又是針對(duì)目標(biāo)抗原的特異性免疫反應(yīng)。輸注到體內(nèi)后，CAR-T細(xì)胞作為“活藥”持續(xù)對(duì)預(yù)期的惡性細(xì)胞發(fā)起細(xì)胞毒性攻擊。它們自己的壽命和體內(nèi)未來(lái)的擴(kuò)展決定了它們強(qiáng)大的腫瘤殺傷能力將持續(xù)多久。然而，不可能充分控制CAR-T細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子量或這些細(xì)胞的體內(nèi)擴(kuò)展?fàn)顟B(tài)，這是CRS、細(xì)胞因子風(fēng)暴和“靶向腫瘤外”反應(yīng)等不良事件的潛在來(lái)源。

由CAR-T細(xì)胞制成的外泌體具有巨大的治療潛力，因?yàn)樗鼈兛梢匀〈鶦AR-T細(xì)胞，瞄準(zhǔn)腫瘤細(xì)胞。外泌體可以作為癌癥治療的直接對(duì)手，取代CAR-T細(xì)胞，由于它們的無(wú)細(xì)胞性質(zhì)和生物學(xué)特性，具有明顯的優(yōu)勢(shì)。首先，使用外泌體作為“現(xiàn)成”試劑使CRS可控。外泌體的適當(dāng)使用也為CAR-T技術(shù)治療實(shí)體瘤鋪平了道路，包括由于它們的納米尺寸而針對(duì)特定區(qū)域的腫瘤，如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。第三，除了CAR-T細(xì)胞的內(nèi)在細(xì)胞因子外，還可以向CAR-T細(xì)胞衍生的外泌體中添加額外的攻擊者以防止?jié)撛诘目顾幮裕�第四，這兩種平臺(tái)（即CAR-T細(xì)胞和CAR-T細(xì)胞衍生的外泌體）的聯(lián)合和/或交替使用無(wú)疑將加強(qiáng)基于CAR的癌癥治療的應(yīng)用。

根據(jù)圖3所示的在臨床環(huán)境中使用CAR-T細(xì)胞衍生的外泌體的提出方法，收集癌癥患者的外周血T細(xì)胞，將CAR通過(guò)病毒或非病毒方式插入T細(xì)胞，體外擴(kuò)展CAR工程化的T細(xì)胞，分離外泌體，然后給患者外泌體�；�于外泌體的獨(dú)特特性，如大小（30-150納米）、密度（1.1-1.18 g/ml）和進(jìn)化上保守的蛋白質(zhì)分子集合（CD9、CD63、CD81、Alix和Tsg101），可以從培養(yǎng)基中使用多種技術(shù)分離CAR-T細(xì)胞衍生的外泌體，包括超濾、超速離心和抗體偶聯(lián)磁珠上的親和捕獲。

圖3 目標(biāo)識(shí)別的進(jìn)展、提高腫瘤穿透性、毒性管理以及研究聯(lián)合療法為CAR-T細(xì)胞療法成功應(yīng)用于實(shí)體瘤提供了樂(lè)觀的前景。這些進(jìn)步使我們更接近于個(gè)性化和精準(zhǔn)的癌癥治療。收集癌癥患者的外周血樣本以分離總的有核細(xì)胞。然后，在存在T細(xì)胞刺激因子（如CD3和CD28抗體）的條件下培養(yǎng)這些細(xì)胞。通過(guò)病毒或非病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)引入嵌合抗原受體（CARs）對(duì)選定的CD8+T細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾。進(jìn)一步擴(kuò)展CAR工程化的T細(xì)胞。從CAR-T細(xì)胞中分離出外泌體。最后，在化療預(yù)處理后，將分離出的外泌體重新輸回同一患者體內(nèi)。

在使用CAR-T細(xì)胞衍生的外泌體進(jìn)行任何臨床設(shè)置之前，確實(shí)有必要進(jìn)行臨床前研究以對(duì)它們進(jìn)行表征�？傊�，一種有希望的癌癥治療方法是基于CAR的T細(xì)胞過(guò)繼性免疫療法。作為一種前沿且有效的治療方法，由于癌癥的復(fù)雜性和不穩(wěn)定性，它正遇到一些缺陷或限制。從CAR-T細(xì)胞衍生的外泌體可能取代CAR-T細(xì)胞，作為終極攻擊者，作為這種有效方式的延伸，從而克服當(dāng)前治療模型中的一些缺點(diǎn)。通過(guò)適當(dāng)整合細(xì)胞和外泌體平臺(tái)，這種有效的治療方法將變得更加功能強(qiáng)大，并應(yīng)使我們更接近于創(chuàng)造一種新的針對(duì)性癌癥治療選擇。

此外，作為未來(lái)發(fā)展，我們可以參考選擇性地裝載所需的mRNA或控制目標(biāo)基因裝載在外泌體中。最近的研究提出了選擇性裝載mRNA或控制目標(biāo)基因裝載到外泌體中的策略。這包括工程化供體細(xì)胞、修改外泌體表面和使用合成納米顆粒。未來(lái)的進(jìn)展旨在增強(qiáng)特定轉(zhuǎn)錄物的靶向和整合，提高穩(wěn)定性，并優(yōu)化裝載效率。創(chuàng)新的基因遞送系統(tǒng)和識(shí)別外泌體和受體細(xì)胞上的具體標(biāo)記可以實(shí)現(xiàn)精確的貨物遞送。這些發(fā)展為精準(zhǔn)醫(yī)療和基因治療等治療應(yīng)用帶來(lái)了希望。