利用NIR-II碳點(diǎn)對(duì)耐藥細(xì)菌和免疫系統(tǒng)防御細(xì)菌感染過(guò)程進(jìn)行成像

本文要點(diǎn)：體內(nèi)熒光成像技術(shù)能夠準(zhǔn)確獲取動(dòng)態(tài)生物信息，對(duì)于細(xì)菌感染病癥的早期診斷和治療起到了至關(guān)重要的作用。本研究中，使用Cy7-CH3作為碳源，多巴胺鹽酸鹽作為表面緩沖劑，合成了一種近紅外II發(fā)射的碳點(diǎn)納米探針（CyCDs）。值得注意的是，碳源的π共軛體系和剛性平面結(jié)構(gòu)可以擴(kuò)展吸收和發(fā)射波長(zhǎng)范圍。氨基的存在使得CyCDs具有正電荷的zeta電位（+0.32 mV），有助于促進(jìn)CyCDs與細(xì)菌的相互作用。有趣的是，CyCDs只能染色耐藥細(xì)菌的細(xì)胞壁，而正常細(xì)菌在整個(gè)細(xì)胞上都有明亮的熒光信號(hào)。這一現(xiàn)象使得能夠在體外鑒別出耐藥細(xì)菌。此外，CyCDs可以用于監(jiān)測(cè)免疫系統(tǒng)與感染細(xì)菌之間的相互作用，并指導(dǎo)及時(shí)使用抗生素。

 

 

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CyCDs的制備可以通過(guò)在甲醇溶液中將Cy7-CH3和多巴胺鹽酸鹽在高壓釜中加熱至180攝氏度，保持4小時(shí)，然后通過(guò)硅膠柱色譜純化（見(jiàn)圖1）來(lái)輕松完成。

 

圖2介紹了通過(guò)溶劑熱處理法合成的具有NIR-II發(fā)射的碳點(diǎn)（CyCDs）的性質(zhì)和特征。CyCDs呈球狀結(jié)構(gòu)，平均直徑為3.11nm，具有良好的晶格結(jié)構(gòu)。XRD和HR-TEM表征確認(rèn)它們?yōu)榫�體，具有高穩(wěn)定性，其成分主要為由C（80.82%）、O（15.08%）和極低比例的N（4.1%）組成；表面帶正電性質(zhì)，富含氨基。光學(xué)性質(zhì)方面，CyCDs在近紅外區(qū)域顯示熒光，并具有穩(wěn)定的熒光特性，可作為生物成像的熒光探針。其絕對(duì)熒光量子效率（Φf）達(dá)到15.3%，相比于前體物質(zhì)Cy7-CH3有顯著提升。

圖2.CyCDs的表征結(jié)果

 

圖3說(shuō)明了CyCDs表面上的氨基使其能夠快速接近并與金黃色葡萄球菌等細(xì)菌發(fā)生作用。細(xì)菌的細(xì)胞壁含有帶負(fù)電荷的磷酸成分，可以與CyCDs表面的磷酸基團(tuán)結(jié)合。在共聚焦激光掃描顯微鏡下觀察到，金黃色葡萄球菌的細(xì)胞表面在與CyCDs共孵育1分鐘后會(huì)快速發(fā)亮。隨著共孵育時(shí)間的增加，細(xì)菌的熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)，但仍然保持在細(xì)菌的表面上，類(lèi)似的現(xiàn)象也在與其他耐藥細(xì)菌混合后與CyCDs接觸時(shí)觀察到。與此同時(shí)，CyCDs也能迅速穿透正常細(xì)菌，并發(fā)出強(qiáng)烈的熒光信號(hào)，表明基于CyCDs的熒光成像能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)耐藥細(xì)菌的特異性識(shí)別。

圖3.NIR-II成像CyCDs特異性識(shí)別耐藥細(xì)菌

 

圖4說(shuō)明了對(duì)于實(shí)現(xiàn)近紅外二區(qū)熒光成像，首先進(jìn)行了CyCDs溶液的體外成像實(shí)驗(yàn)。隨著CyCDs濃度增加，溶液的NIR-II熒光信號(hào)相應(yīng)增強(qiáng)。此外，在低濃度下也可以通過(guò)調(diào)整曝光時(shí)間產(chǎn)生NIR-II熒光信號(hào)，為體內(nèi)細(xì)菌檢測(cè)提供了可能。接著，通過(guò)將CyCDs與細(xì)菌（金黃色葡萄球菌和大腸桿菌）在體外共培養(yǎng)5分鐘，研究了CyCDs對(duì)細(xì)菌的標(biāo)記效率。結(jié)果顯示，在細(xì)菌沉淀中能檢測(cè)到強(qiáng)烈的熒光信號(hào)，而在離心后上清液中沒(méi)有熒光信號(hào)，證明了CyCDs能夠迅速成功地標(biāo)記細(xì)菌。此外，在使用1100納米長(zhǎng)通濾光片過(guò)濾后，細(xì)菌沉淀中觀察到最強(qiáng)的熒光信號(hào)，暗示了與細(xì)菌相互作用后，CyCDs的發(fā)射峰可能發(fā)生了紅移。總的來(lái)說(shuō)，CyCDs在體外表現(xiàn)出高效的細(xì)菌標(biāo)記能力，為體內(nèi)細(xì)菌檢測(cè)提供了有前景的探針。

圖4.NIR-II體外成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果

 

圖5描述了在活體BALB/c小鼠模型中進(jìn)行的針對(duì)金黃色葡萄球菌感染的近紅外二區(qū)熒光成像實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在感染部位迅速出現(xiàn)了熒光信號(hào)，而對(duì)照組則沒(méi)有。隨后觀察到熒光信號(hào)區(qū)域從注射后的10分鐘到5小時(shí)內(nèi)增加，并在5小時(shí)時(shí)達(dá)到峰值，反映了細(xì)菌數(shù)量的激增。隨后在注射后24小時(shí)，熒光信號(hào)區(qū)域下降，表明免疫系統(tǒng)攻擊了侵入的細(xì)菌，導(dǎo)致了細(xì)菌負(fù)載的減少。最后，在缺乏進(jìn)一步處理的情況下，從注射后48小時(shí)開(kāi)始，熒光信號(hào)和區(qū)域增加，表明細(xì)菌負(fù)載隨時(shí)間增加。此外，通過(guò)姬式染色法進(jìn)一步驗(yàn)證了感染部位7天后的細(xì)菌殘留情況。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NIR-II成像可以準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)整個(gè)細(xì)菌感染過(guò)程。同時(shí)，通過(guò)分析炎癥因子，如IL-6、CD11B、TNF-α和MCP-1，也可以評(píng)估免疫和炎癥反應(yīng)的變化，進(jìn)一步研究了細(xì)菌感染與免疫系統(tǒng)的相互作用。

 

在這項(xiàng)研究中，科研人員通過(guò)將青菁染料和多巴胺鹽酸鹽作為原材料，采用溶劑熱反應(yīng)形成了CyCDs（直徑約3.11nm），其在1100至1200nm范圍內(nèi)顯示明顯的NIR-II發(fā)射，峰值位于1160nm。CyCDs表面的氨基使其能夠迅速高效地與細(xì)菌結(jié)合，使得其在PBS緩沖液中具有低背景熒光的特點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)了高性能的無(wú)水洗細(xì)菌成像。由于耐藥細(xì)菌表面存在外流泵系統(tǒng)，CyCDs只能染色耐藥細(xì)菌表面，而正常細(xì)菌的熒光信號(hào)會(huì)覆蓋整個(gè)細(xì)胞，這實(shí)現(xiàn)了對(duì)耐藥細(xì)菌的體外識(shí)別。NIR-II熒光成像實(shí)驗(yàn)證明，所得的CyCDs可以長(zhǎng)期檢測(cè)細(xì)菌負(fù)載的動(dòng)態(tài)變化，并反映了免疫系統(tǒng)與細(xì)菌感染之間的關(guān)系，有助于未來(lái)臨床實(shí)踐中抗生素治療的優(yōu)化。

 

參考文獻(xiàn)

Liu, W.; Wu, B.; Sun, W.; Liu, W.; Gu, H.; Du, J.; Fan, J.; Peng, X., Near-infrared II fluorescent carbon dots for differential imaging of drug-resistant bacteria and dynamic monitoring of immune system defense against bacterial infection in vivo. Chemical Engineering Journal 2023, 471.

 

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