PTI全自動(dòng)多肽合成儀在優(yōu)化肽核酸PNA合成中的應(yīng)用

瀏覽次數(shù)：644　發(fā)布日期：2023-12-15　來(lái)源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

介紹
肽核酸(PNA)是DNA和/或RNA的合成類似物，因?yàn)檎麄€(gè)磷酸二酯鍵主鏈被擬肽主鏈取代，核酸堿基通過(guò)甲基羰基連接，具有幾種獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì) (圖1)。[1]

PNAs是一種非離子核酸類似物，其中性聚酰胺骨架設(shè)計(jì)可最小化DNA寡核苷酸中經(jīng)常觀察到的非特異性靜電效應(yīng)。因此，短至12個(gè)堿基的序列即允許強(qiáng)的特異性雜交，具有改進(jìn)的序列錯(cuò)配分辨率，比天然寡核苷酸對(duì)單點(diǎn)突變更敏感。此外，與天然肽或核酸相比，PNAs對(duì)核酸酶和蛋白酶的抗性更強(qiáng)。[2]

PNAs能夠通過(guò)與互補(bǔ)RNA結(jié)合抑制基因表達(dá)；在一定條件下，PNAs還可以通過(guò)鏈入侵機(jī)制與DNA雙鏈序列結(jié)合促進(jìn)基因表達(dá)，從而促進(jìn)D-loop的形成和相應(yīng)基因的表達(dá)。它們的高親和力和特異性使它們不僅可以作為治療藥物，而且可以用于診斷。[3,4]

PNAs的合成通常被認(rèn)為是一個(gè)挑戰(zhàn)，因?yàn)樗鼈內(nèi)菀拙奂�，并且脫保護(hù)步驟通常伴隨著副反應(yīng)。[5]克服第一個(gè)問(wèn)題的策略之一是在耦合步驟中使用大量過(guò)量的試劑；然而，合成所需的受N端保護(hù)的PNA單體相對(duì)昂貴，使得這種方法經(jīng)濟(jì)成本偏高。

在本應(yīng)用筆記中，我們報(bào)告了使用全自動(dòng)多肽合成儀PurePep®Chorus合成PNA的方法優(yōu)化。以PNA1作為參考序列，評(píng)估不同的合成條件：偶聯(lián)次數(shù)、PNA單體過(guò)量倍數(shù)、反應(yīng)時(shí)間和溫度。得到粗品純度最高的PNA1的最佳條件，然后用于合成其他五個(gè)長(zhǎng)度和嘌呤(腺嘌呤和鳥嘌呤)含量不同的序列(表1)。后者構(gòu)成了合成的一個(gè)相關(guān)因素，因?yàn)樗鼈兊呐悸?lián)通常由于偶聯(lián)單體的位阻困難而導(dǎo)致低產(chǎn)率。

結(jié)果與討論
采用低負(fù)荷Rink Amide MBHA樹(shù)脂(0.27 mmol.g-1)，采用Fmoc/tBu正交保護(hù)方案，采用PurePep®Chorus (Gyros Protein Technologies)以25 μmol的濃度規(guī)模合成PNA1。在室溫下，用20%Pip/DMF進(jìn)行2 × 5分鐘的樹(shù)脂脫保護(hù)。偶聯(lián)步驟是在HCTU和NMM存在的情況下進(jìn)行的，在所有的合成過(guò)程中，條件都有很大的不同(表2)。偶聯(lián)步驟之后是一個(gè)封端步驟，在室溫下，用10%的Acetic Anhydride/DMF溶液，反應(yīng)5分鐘。最終脫保護(hù)后，用TFA/ TIS/H2O(95:2.5:2.5)溶液在室溫下裂解4小時(shí)。

通過(guò)分析表2可以看出，使用10倍當(dāng)量的PNA單體可以得到非常好的粗純度(81%);然而，這種合成方法經(jīng)濟(jì)成本高，因?yàn)镕moc保護(hù)的PNA單體是昂貴的。通過(guò)將PNA的過(guò)量倍數(shù)降至4 倍當(dāng)量，粗品純度會(huì)降至72%。在保持低過(guò)量PNA單體的條件下，將反應(yīng)溫度提高到45℃，反應(yīng)時(shí)間縮短到5 min，會(huì)進(jìn)一步降低粗品純度(61%)。由于反應(yīng)時(shí)間5分鐘可能太短而無(wú)法完成偶聯(lián)，因此采用相同的條件，但反應(yīng)時(shí)間增加到10分鐘(實(shí)驗(yàn)D)，得到的粗純度(82%)與實(shí)驗(yàn)A相似，實(shí)驗(yàn)A使用了兩倍多的PNA單體。E方法采用雙偶聯(lián)的方法，對(duì)反應(yīng)作進(jìn)一步優(yōu)化。使用相同數(shù)量的原料總當(dāng)量和相同的時(shí)間，粗品純度進(jìn)一步提高了5%。

當(dāng)確定了產(chǎn)生最佳粗純度PNA1的耦合方案，使用相同的策略(方法E)合成其余序列。結(jié)果如表3所示。

合成的PNA序列的粗純度在66-91%之間，可以認(rèn)為是很好的粗品收率，特別是對(duì)于肽核酸。有趣的是，嘌呤含量較高的PNA序列具有較好的粗品純度。

結(jié)論
在本應(yīng)用筆記中，我們描述了使用全自動(dòng)多肽合成儀PurePep® Chorus合成PNA的耦合策略的優(yōu)化。我們首先在室溫下使用10倍當(dāng)量的PNA單體進(jìn)行1小時(shí)的偶聯(lián)反應(yīng)，該策略產(chǎn)生了非常好的粗品PNA(81%)。我們希望減少單體原料的過(guò)量倍數(shù)，同時(shí)盡量減少粗品純度的損失，使這種反應(yīng)在經(jīng)濟(jì)上更具可持續(xù)性和“綠色”。最終，我們開(kāi)發(fā)了一種耦合策略，不僅減少了當(dāng)量的數(shù)量和反應(yīng)時(shí)間，而且產(chǎn)生了比原始策略更好的粗品PNA。通過(guò)在45℃下進(jìn)行雙耦合，每次2 倍當(dāng)量，持續(xù)5分鐘，我們能夠?qū)NA1的粗純度從81%提高到87%。最后，將該耦合策略應(yīng)用于其他序列的合成。該方案應(yīng)用于具有不同的長(zhǎng)度和嘌呤含量的序列，產(chǎn)生了非常好的粗肽核酸。PurePep® Chorus被證明是這項(xiàng)工作的關(guān)鍵工具，因?yàn)樵赑urePep® Chorus全自動(dòng)多肽合成儀上，從當(dāng)量、重復(fù)次數(shù)、反應(yīng)溫度、耦合時(shí)間等合成程序均可以很容易地調(diào)整。

參考文獻(xiàn)
[1]   P. E. Nielsen, R. H. Berg, Sci 1991, 6, 254(5037), 1497-1500.
[2]   A. Gupta et al., J Biotechnol 2017, 259, 148–159.
[3]   P. E. Nielsen, Chem Biodivers 2010, 7(4), 786-804.
[4]   C. Cordier et al., PLoS One 2014, 9, e104999.
[5]   C. Li, ACS Cent Sci 2022, 8, 2, 205–213.
[6]   D. Al Sulaiman et al., Angew Chem Int Ed 2017, 56, 5247–5251.
[7] “Low-Scale Automated Synthesis of a PNA-Peptide Conjugate on the Prelude®”
(Application Note 12; D0029149/B).
[8]   L. Goltermann et al., Front Microbiol 2019, 10, 1032.
[9]   C. Avitabile et al., Tetrahedron Lett 2010, 51, 3716–3718

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