PTI高通量多肽合成儀在合成熒光標(biāo)記肽毒素中的應(yīng)用

介紹
來(lái)自動(dòng)物的肽毒素是離子通道的有效抑制劑，無(wú)論是作為治療一系列疾病的藥物還是作為藥物研究的寶貴工具，都顯示出巨大的前景。法國(guó)的一個(gè)研究小組已經(jīng)探索了一種蝎子肽BeKm-1的熒光標(biāo)記方法，這種肽可以抑制hERG離子通道。hERG離子通道與心臟活動(dòng)有關(guān)，在開(kāi)發(fā)新藥時(shí)必須避免阻斷它。研究小組的方法包括蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)對(duì)接研究，使他們能夠識(shí)別肽鏈中適合標(biāo)記的溶劑暴露殘基。這使他們能夠設(shè)計(jì)和測(cè)試保持天然肽的特異性和作用方式的類(lèi)似物。

肽毒素——藥物先導(dǎo)化合物和藥物研發(fā)工具的金礦
來(lái)自陸地和海洋動(dòng)物的肽毒素是研究離子通道在生理和病理?xiàng)l件下所起作用的寶貴工具。僅蝎子毒液就含有多達(dá)320種肽毒素，這些肽毒素作用于41種不同的離子通道(1)。幾種毒素衍生的肽也已成為治療糖尿病、高血壓、慢性疼痛和其他疾病的藥物，同時(shí)有數(shù)十種處于臨床前開(kāi)發(fā)或正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)(2)。一個(gè)例子是FDA批準(zhǔn)的多肽藥物Prialt®或Ziconotide，這是一種合成的25個(gè)氨基酸的肽，發(fā)現(xiàn)于海蝸牛的毒液中，可以阻斷N型電壓門(mén)控鈣離子通道。Ziconotide作為全身鎮(zhèn)痛藥，適用于鞘內(nèi)嗎啡不耐受或難治性慢性嚴(yán)重疼痛的患者(3)。成千上萬(wàn)的多肽仍有待研究，作為可能的藥理工具或藥物先導(dǎo)化合物(4)。

設(shè)計(jì)毒素靶向hERG離子通道
該領(lǐng)域的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素是目標(biāo)通道晶體結(jié)構(gòu)的可用性和對(duì)毒素結(jié)合的研究，這為設(shè)計(jì)毒素類(lèi)似物開(kāi)辟了可能性。一個(gè)例子是hERG通道，它與EAG -1通道同屬于EAG(ether-go-go)電壓門(mén)控K+通道家族。

編碼hERG通道的基因KCNH2突變可導(dǎo)致長(zhǎng)QT間期延長(zhǎng)綜合征(LQT)， LQT綜合征涉及心室復(fù)極延長(zhǎng)，可導(dǎo)致心臟驟停。LQT也可由阻斷hERG的藥物引起，包括抗生素、抗精神病藥物和抗組胺藥。這種相互作用是藥物開(kāi)發(fā)的主要挑戰(zhàn)，必須在開(kāi)發(fā)過(guò)程的早期進(jìn)行研究。

評(píng)估hERG的一個(gè)有力工具是以毒素肽BeKm-1 (IC50 =3.3 nM)形式存在的有效阻斷劑，該毒素肽是從蝎子Buthus eupeus的毒液中分離出來(lái)的。法國(guó)Molsamcules Max Mousseron研究所、Pole d'expertise Biotechnology公司和Smartox Biotechnology公司合作設(shè)計(jì)了BeKm-1的熒光類(lèi)似物，專(zhuān)門(mén)結(jié)合hERG通道，目的是開(kāi)發(fā)能夠保持正確結(jié)合和抑制該通道的熒光類(lèi)似物(5)。

支持殘基選擇的模型
該團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一個(gè)試驗(yàn)?zāi)Ｐ�，使用四聚體hERG通道結(jié)構(gòu)來(lái)預(yù)測(cè)BeKm-1與hERG外部部分的結(jié)合，以幫助識(shí)別肽毒素上暴露于溶劑中的殘基，可用于連接化學(xué)基團(tuán)。分子模擬研究表明，肽毒素的α-螺旋與hERG結(jié)合位點(diǎn)底部的疏水表面接觸，并且N端 Arg-1和Arg-27的側(cè)鏈在所有結(jié)合模式下都暴露于溶劑，因此決定選擇這些殘基進(jìn)行化學(xué)標(biāo)記。

BeKm-1類(lèi)似物的設(shè)計(jì)與合成
該團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)并合成了四種熒光BeKm-1類(lèi)似物(圖1)。BeKm-1的N端用于將連接物連接到三種類(lèi)似物上:4-戊酸(+ 4個(gè)碳原子; linker 4)，6-疊氮己酸(+6個(gè)碳原子; linker 6)，或10-十一烷酸(+ 10個(gè)碳原子;linker 10)。所有這些連接子都兼容點(diǎn)擊化學(xué)(linker 4和linker 10的炔功能，linker 6的疊氮化物功能)。第四個(gè)BeKm-1類(lèi)似物是基于Arg-27的溶劑可及性，但由于Arg-27不參與hERG通道識(shí)別，殘基被含有炔功能的點(diǎn)擊化學(xué)兼容的Lys殘基所取代。然后將帶有額外間隔的Cy5染料基團(tuán)連接到肽上。
 

在連接子偶聯(lián)到36-mer BeKm-1序列的N端之前，在Symphony®X全自動(dòng)多肽合成儀上使用Fmoc固相化學(xué)逐步合成多肽鏈。在BeKm-1 Lys-27中，野生型L-Arg-27殘基被L-Lys(pentynoyl)-OH取代。間隔物GS在C端包含左丙炔甘氨酸(Pra)，在側(cè)鏈上具有炔基功能，Cy5在N端通過(guò)肽鍵偶聯(lián)。

所有多肽合成采用2-氯三甲基氯樹(shù)脂。經(jīng)過(guò)樹(shù)脂裂解和脫保護(hù)，粗毒素類(lèi)似物被折疊/氧化，并通過(guò)C18反相色譜(RP-HPLC)純化。利用點(diǎn)擊化學(xué)方法將Cy5 與連接子偶聯(lián)得到Cy5- PEG3 -linker4- BeKm-1、Cy5- PEG5 -linker10- BeKm -1、Cy5-spacer- GS -linker6- BeKm -1和Cy5- PEG5 - BeKm -1 Lys275。所有產(chǎn)物均經(jīng)反相高效液相色譜純化。

類(lèi)似物保留特異性和作用方式，但親和力降低
利用非洲爪蟾卵母細(xì)胞中表達(dá)的hERG通道，對(duì)熒光標(biāo)記BeKm-1的效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)。所有類(lèi)似物均表現(xiàn)出劑量依賴(lài)性的外向電流抑制作用，但I(xiàn)C50值(60-80 nM)高于天然毒素肽(12 nM;圖2). BeKm-1和四個(gè)類(lèi)似物的Hill系數(shù)都接近于1，表明它們具有相同的作用模式。
 

天然BeKm-1及其類(lèi)似物對(duì)hERG的特異性可以通過(guò)對(duì)密切相關(guān)的K+通道hEAG1缺乏影響來(lái)證實(shí)，而對(duì)一種抗BeKm-1抑制的突變形式的hERG進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)顯示，天然肽及其類(lèi)似物對(duì)hERG的特異性相似�？偟慕Y(jié)論是，這些類(lèi)似物具有與天然肽相同的特異性和作用方式，但對(duì)hERG離子通道的親和力較低。

一種開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)毒素肽的有前景的方法
這項(xiàng)研究說(shuō)明了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)對(duì)接工具如何用于修飾毒素肽的設(shè)計(jì)，這些修飾毒素肽可以用作離子通道成像或生物化學(xué)純化/表征中的報(bào)告分子。這樣的方法也可以提供有價(jià)值的工具來(lái)研究新的候選藥物對(duì)離子通道的不良副作用，表征肽毒素的作用模式，并為藥物開(kāi)發(fā)開(kāi)辟新的可能性。

正如Smartox Biotechnology CSO和INSERM高級(jí)研究主任Michel De Waard博士所指出的那樣，Symphony® X全自動(dòng)多肽合成儀在這項(xiàng)工作中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。“Symphony® X是我們?cè)赟martox合成能力的寶貴補(bǔ)充。作為GPT產(chǎn)品的長(zhǎng)期用戶(hù)，我們不僅依賴(lài)于該儀器的堅(jiān)固結(jié)構(gòu)和可靠性能，而且在生產(chǎn)含非天然氨基酸和特殊化學(xué)物質(zhì)的多肽時(shí)，該儀器提供了更大的靈活性。能夠同時(shí)合成多種肽類(lèi)似物是一個(gè)巨大的優(yōu)勢(shì)，使我們能夠提高我們實(shí)驗(yàn)室多肽合成的效率和生產(chǎn)力。”

高通量多肽合成儀Symphony® X介紹

Symphony® X是由美國(guó)多肽合成儀領(lǐng)軍品牌PTI（GPT）推出的經(jīng)典產(chǎn)品，儀器24通道設(shè)計(jì)，采用固相合成的原理，可以同時(shí)合成24條不同序列的多肽。儀器具有40個(gè)氨基酸位、8個(gè)試劑瓶位，為客戶(hù)的研究、優(yōu)化和生產(chǎn)提供最大的靈活性。

*24個(gè)平行的獨(dú)立反應(yīng)通道，可同時(shí)在多個(gè)RV上運(yùn)行不同的合成規(guī)模、多肽序列和反應(yīng)條件，或在運(yùn)行其他項(xiàng)目時(shí)按需使用

*12個(gè)通道可作預(yù)活化

*反應(yīng)溶液的實(shí)時(shí)紫外線(xiàn)監(jiān)測(cè)，而不是混合過(guò)程中的廢液檢測(cè)，以控制脫保護(hù)時(shí)間，并盡量減少多余的廢物，以獲得更好的純度和產(chǎn)量

*快速紅外加熱

*Single Shot^TM單次添加技術(shù)，幾乎沒(méi)有死體積

References

1.  Scorpion toxin peptide action at the ion channel subunit level. Housley, D.M et al. 2017.

Neuropharmacology 127, 46–78.

2.  Pharmacokinetics of Toxin-Derived Peptide Drugs. Stepensky, D. Toxins 2018, 10, 483;

doi:10.3390/toxins10110483.

3.  Toxins in Drug Discovery and Pharmacology. Peigneur S & Tytgat J. Toxins (Basel). 2018 Mar 16;10(3). pii: E126. doi: 10.3390/toxins10030126.

4.  de Souza, J.M., et al, 2018. Animal toxins as therapeutic tools to treat neurodegenerative

diseases. Front. Pharmacol. 9, 145.

5.  Fluorescent analogues of BeKm-1 with high and specific activity against the hERG channel.

Vasseur, L et al Toxicon: X, Volume 2, April 2019, 100010