LXN通過(guò)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞中細(xì)絲蛋白A的蛋白水解切割調(diào)控細(xì)胞骨架重塑

內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）在體內(nèi)持續(xù)暴露于血流動(dòng)力學(xué)剪切應(yīng)力。當(dāng)ECs感知剪切應(yīng)力時(shí)，它們會(huì)改變細(xì)胞形態(tài)、功能和基因表達(dá)，并參與生理和病理血管生物學(xué)。對(duì)此，在血管中報(bào)道了兩種類(lèi)型的剪切應(yīng)力：一種是層流剪切應(yīng)力，另一種是擾動(dòng)剪應(yīng)力。層流剪切應(yīng)力（LSS）具有血管保護(hù)作用，位于直動(dòng)脈區(qū)域（如胸主動(dòng)脈），而擾動(dòng)剪切應(yīng)力（DSS）對(duì)血管有害，并且位于分支或彎曲區(qū)域（例如主動(dòng)脈弓）。有趣的是，研究表明，血管分支所在的血管通透性增加，動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)也隨之增加。

剪切應(yīng)力的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)是復(fù)雜的。可以粗略地確定，剪切應(yīng)力通過(guò)細(xì)胞膜分子激活各種傳導(dǎo)途徑，包括鈣通道、G蛋白、酪氨酸激酶受體、粘附蛋白和細(xì)胞骨架。在剪切應(yīng)力作用下，ECs最直觀的表型是形態(tài)變化：ECs經(jīng)歷了從多邊形鵝卵石狀向均勻紡錘狀單層的轉(zhuǎn)變。這種現(xiàn)象被認(rèn)為部分是F-肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維誘導(dǎo)的結(jié)果，然而，由于剪切應(yīng)力導(dǎo)致的這種細(xì)胞骨架組的機(jī)制尚不清楚。

Latexin （LXN） 是一種長(zhǎng) 222 個(gè)氨基酸的羧肽酶抑制劑。由于其蛋白酶抑制劑的特性，人們認(rèn)為L(zhǎng)XN可能參與蛋白質(zhì)降解和代謝。LXN 也與炎癥有關(guān)，因?yàn)樗�在巨噬�?xì)胞和肥大細(xì)胞中表達(dá)，并且可以由脂多糖誘導(dǎo)。然而，LXN在ECs中的作用尚不清楚。

基于此，在廣西師范大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)學(xué)院、廣西民族藥省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心及桂林醫(yī)學(xué)院智能醫(yī)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院課題團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)研究中，發(fā)現(xiàn)層流剪切應(yīng)力誘導(dǎo) ECs 中 LXN 的下調(diào)，從而導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)變化和 F-肌動(dòng)蛋白重塑，類(lèi)似于 LSS 在 ECs 中的作用那樣。從邏輯上講，研究人員假設(shè) LXN 是一種新型調(diào)節(jié)因子，參與內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)變化過(guò)程，并且 LXN 缺失對(duì)血管穩(wěn)態(tài)具有保護(hù)作用。研究成果發(fā)表在 Journal of Cellular and Molecular Medicine 期刊題為“LXN deficiency regulates cytoskeleton remodelling by promoting proteolytic cleavage of Filamin A in vascular endothelial cells”。

首先，HUVECs承受15 dynes/cm² 的層流剪切應(yīng)力持續(xù)12小時(shí)（圖1），結(jié)果觀察LSS誘導(dǎo)細(xì)胞形狀變化（圖1 A），上調(diào)血管保護(hù)基因（如CPY1B1、THBD和NOS3），但下調(diào)促動(dòng)脈粥樣硬化基因（如VCAM1、CD36和ANGPT2）（圖1 B）。有趣的是，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LSS以時(shí)間依賴(lài)性方式顯著抑制HUVECs中LXN的表達(dá)（圖1 C-E），這促使研究人員思考LXN是否參與了ECs的功能調(diào)控。

為了探究LXN在內(nèi)皮細(xì)胞中的功能作用，采用功能缺失策略。QPCR結(jié)果顯示，LXN敲低降低了HUVECs中ANGPT2，但增加了THBD和NOS3的表達(dá)，表明 LXN 敲低在 ECs 中具有血管保護(hù)功能。有趣的是，在LXN敲低ECs中觀察到細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化和細(xì)胞骨架重塑，與LSS引起的ECs形態(tài)變化相似（圖1 A）。轉(zhuǎn)染CTL siRNA的ECs形態(tài)隨機(jī)排列，呈均勻多邊形，而用 LXN siRNA 轉(zhuǎn)染的 ECs 從典型的鵝卵石狀拉長(zhǎng)到均勻紡錘狀排列，其方向與在LSS下生長(zhǎng)的細(xì)胞在外觀上相似，并且LSS誘導(dǎo)的ECs形態(tài)變化可通過(guò)LXN的過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)。

通過(guò)F-肌動(dòng)蛋白染色進(jìn)一步研究了LXN缺失對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞骨架重塑的影響。結(jié)果觀察到，LXN敲低導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維的形成，主要在ECs中F-肌動(dòng)蛋白絲的縱向分布中運(yùn)行。有趣的是，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ECs在對(duì)照條件下表現(xiàn)出大而頻繁的板狀偽足形成，然而，LXN敲低細(xì)胞中的板狀偽足形成減少。這些數(shù)據(jù)清楚地表明，LXN至少參與了ECs中的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)變化和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組。
 

圖1 層流剪切應(yīng)力下調(diào)HUVECs中LXN的表達(dá)。

接下來(lái)，為了探究LXN調(diào)控內(nèi)皮形態(tài)的機(jī)制，進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)篩選，以鑒定ECs中LXN的細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)，為此，裂解HUVECs，并用抗LXN抗體進(jìn)行免疫沉淀。FLNA是一種支架蛋白，被確定為L(zhǎng)XN的潛在伴侶，通過(guò)免疫沉淀和蛋白質(zhì)印跡進(jìn)一步驗(yàn)證了這種相互作用。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了內(nèi)源性LXN在HUVECs中與FLNA完全形成物理復(fù)合物。數(shù)據(jù)強(qiáng)烈表明，F(xiàn)LNA 可能參與與 LXN 的結(jié)合并在 ECs 中形成復(fù)合物。

細(xì)絲蛋白A（Filamin A，F(xiàn)LNA）是一種肌動(dòng)蛋白交聯(lián)蛋白，可調(diào)節(jié)與細(xì)胞形態(tài)變化和運(yùn)動(dòng)有關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件。由于 LXN 調(diào)節(jié)細(xì)胞形狀，因此在研究中觀察到 ECs 中細(xì)胞骨架的變化和肌動(dòng)蛋白重塑。LXN與FLNA的相互作用促使研究人員評(píng)估了LXN是否影響ECs中的FLNA蛋白水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LXN敲低不影響FLNA的mRNA水平（圖2 A），但顯著降低了ECs中FLNA的蛋白水平（圖2 B）。有趣的是，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)大約190 kD的新條帶，它也可以被FLNA抗體識(shí)別，表明FLNA可能被降解（圖2 B）。FLNA對(duì)鈣蛋白酶的蛋白水解非常敏感，因此，實(shí)驗(yàn)推測(cè)LXN是否調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞中的鈣蛋白酶活性。

實(shí)驗(yàn)觀察到，LXN敲低ECs中的鈣蛋白酶活性增加（圖2 C）。因此，用鈣蛋白酶抑制劑Calpeptin處理LXN敲低ECs，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡測(cè)定FLNA及其片段，發(fā)現(xiàn)LXN敲低導(dǎo)致FLNA減少，同時(shí)FLNA裂解增加，然而，這種作用可以通過(guò)Calpeptin抑制（圖2 D）。隨后通過(guò)免疫染色和蛋白質(zhì)印跡進(jìn)一步確定了LXN敲低是否會(huì)影響ECs中全長(zhǎng)和裂解的FLNA亞細(xì)胞定位。免疫染色顯示，F(xiàn)LNA與LXN在細(xì)胞質(zhì)中共定位，LXN敲低顯著促進(jìn)了ECs中FLNA從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的亞細(xì)胞易位（圖2 E、F）。有趣的是，Calpeptin可以逆轉(zhuǎn)LXN敲低誘導(dǎo)的應(yīng)力纖維的形成（圖2 G）。這些數(shù)據(jù)表明，LXN維持了FLNA在細(xì)胞質(zhì)中的穩(wěn)定性，而LXN缺失通過(guò)鈣蛋白酶依賴(lài)性途徑下調(diào)FLNA，促進(jìn)FLNA細(xì)胞核易位。
 

圖2 LXN 敲低調(diào)節(jié) EC 中的 FLNA 蛋白水解裂解和亞細(xì)胞定位。

然后，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討了LXN敲低是否會(huì)影響細(xì)胞骨架蛋白的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，敲低LXN后整合素-β表達(dá)略有升高，而paxillin、Arp2/3和α-actinin表達(dá)顯著降低（圖2 H）。由于據(jù)報(bào)道，樁蛋白（paxillin）與黏著斑（FA）和細(xì)胞骨架錨定的形成有關(guān)，因此接下來(lái)研究了 FLNA 是否對(duì) ECs 中的細(xì)胞骨架錨定有影響，如圖所示4 I、F，在對(duì)照細(xì)胞中隨機(jī)排列的肌動(dòng)蛋白絲與其末端與黏著斑相連。

然而，在LXN敲低細(xì)胞中，肌動(dòng)蛋白絲與黏著斑之間的關(guān)聯(lián)被破壞，黏著斑等結(jié)構(gòu)消失，從而導(dǎo)致F-肌動(dòng)蛋白絲在細(xì)胞縱向上的分布，以及形態(tài)學(xué)變化（圖2 I-i）。接下來(lái)，又敲除ECs中的FLNA（圖2 J），發(fā)現(xiàn)斑塊等局灶性粘附受損，并導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維的形成，主要在EC中F-肌動(dòng)蛋白絲的縱向分布中運(yùn)行（圖2 J-vi），這表明ECs中FLNA的減少有助于應(yīng)力纖維的形成。這些數(shù)據(jù)顯示了，LXN作為FLNA蛋白質(zhì)復(fù)合物的功能作用，參與調(diào)節(jié)ECs中黏著斑形成和肌動(dòng)蛋白絲的錨定。

最后，為了評(píng)估LXN在體內(nèi)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)的作用，對(duì)WT和LXN-/- 小鼠主動(dòng)脈弓內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行染色，觀察細(xì)胞形態(tài)變化和細(xì)胞骨架分布，結(jié)果表明，LXN在體內(nèi)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)變化和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組。接下來(lái)，評(píng)估了LXN缺失對(duì)體內(nèi)血管功能的影響，數(shù)據(jù)表明，LXN敲除顯著降低了微血管的通透性。

然后進(jìn)一步評(píng)估了LXN缺失在動(dòng)脈粥樣硬化中的血管保護(hù)作用，實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了 ApoE‐/- LXN‐/‐ 型雙基因敲除小鼠，用高脂飲食喂養(yǎng)小鼠16周，建立動(dòng)脈粥樣硬化模型。血管舒張能力分析表明，高脂飲食極大地?fù)p害了血管舒張功能。LXN缺失不僅能逆轉(zhuǎn)高脂飲食引起的血管舒張功能障礙，還能顯著改善正常小鼠的血管舒張（圖3 A），進(jìn)一步表明LXN缺失對(duì)血管的保護(hù)作用。最后，也是最重要的一點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)LXN缺失顯著抑制了高脂飲食誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成（圖3 B、C）。這些結(jié)果表明，LXN缺失可以改善小鼠的血管功能，減輕動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成。

圖3 LXN缺失可改善HF誘導(dǎo)的ApoE-/- 小鼠血管舒張能力和動(dòng)脈粥樣硬化。
 

圖4 靜態(tài)和層流剪切應(yīng)力或LXN缺失ECs中細(xì)胞形態(tài)和應(yīng)力纖維網(wǎng)絡(luò)的示意圖。在正常情況下，正常 ECs中的 Arp2/3、α-actinin 和 FLNA 交聯(lián)肌動(dòng)蛋白絲產(chǎn)生橫弧。在層流剪切應(yīng)力下，LXN的丟失導(dǎo)致FLNA的蛋白水解裂解和亞細(xì)胞定位，ECs中Arp2/3、α-actinin和paxillin的下調(diào)。結(jié)果表明，ECs從典型的鵝卵石狀排列拉長(zhǎng)到均勻的紡錘狀排列，并顯示出F-肌動(dòng)蛋白絲在細(xì)胞縱向上的分布。

綜上所述，該研究結(jié)果表明，LXN缺失對(duì)血管具有保護(hù)作用。研究數(shù)據(jù)支持LXN通過(guò)與細(xì)胞骨架蛋白形成復(fù)合物，成為ECs形態(tài)的重要調(diào)節(jié)因子。LXN在血管內(nèi)皮細(xì)胞中直接與FLNA相互作用，這種相互作用是功能性的，因?yàn)長(zhǎng)XN的缺失增強(qiáng)了FLNA蛋白水解裂解和亞細(xì)胞定位，它可能是生理性的，因?yàn)樗�抑制了肌�?dòng)蛋白絲與黏著斑的錨定，并導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)變化，這與層流剪切應(yīng)力對(duì) ECs 的影響相似。重要的是，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LXN缺失可顯著改善小鼠的血管通透性、血管舒張和動(dòng)脈粥樣硬化，這表明LXN缺失對(duì)血管穩(wěn)態(tài)具有保護(hù)作用，為血管疾病的治療提供了新的靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：He G, Kan S, Xu S, Sun X, Li R, Shu W, Chen M. LXN deficiency regulates cytoskeleton remodelling by promoting proteolytic cleavage of Filamin A in vascular endothelial cells. J Cell Mol Med. 2021 Jul;25(14):6815-6827. doi: 10.1111/jcmm.16685. Epub 2021 Jun 3. PMID: 34085389; PMCID: PMC8278077.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34085389/

小編旨在分享、學(xué)習(xí)、交流生物科學(xué)等領(lǐng)域的研究進(jìn)展。如有侵權(quán)或引文不當(dāng)請(qǐng)聯(lián)系小編修正。如有任何的想法以及建議，歡迎聯(lián)系小編。感謝各位的瀏覽以及關(guān)注！
微信搜索公眾號(hào)“Naturethink”，了解更多細(xì)胞體外仿生培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用。

點(diǎn)擊了解
細(xì)胞流體剪切力|共培養(yǎng)|壓力培養(yǎng)|牽張應(yīng)變|血管培養(yǎng)|平行平板流動(dòng)腔|儀器|上海泉眾機(jī)電科技有限公司Naturethink

Naturethink剪切力|細(xì)胞切應(yīng)力|流體剪切應(yīng)力|細(xì)胞流體剪切力|fluid shear stress|細(xì)胞體外培養(yǎng)|仿血流剪切應(yīng)力培養(yǎng)系統(tǒng)