腺相關(guān)病毒(AAV)衣殼蛋白分析技術(shù)助力基因治療藥物研究

基因治療是指將外源正常基因?qū)�入靶�?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償缺陷和異�；�因引起的疾病，以達(dá)到治療目的�；�因治療的載體在基因治療過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，一些病毒制劑和人工遞送技術(shù)已經(jīng)被用來(lái)嘗試安全地將蛋白受體或核酸載體遞送到宿主細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制，起到治療效果。然而，一些病毒載體的不良特性，包括它們的免疫原性，或它們引起的強(qiáng)烈副作用，已經(jīng)導(dǎo)致了嚴(yán)重的臨床不良事件，并限制了它們目前在臨床中的某些應(yīng)用。
 

腺相關(guān)病毒(Adeno-associated virus, AAV)因具有低致病性、對(duì)宿主免疫原性弱、長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)、廣泛的細(xì)胞和組織親嗜性等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛用于研發(fā)和臨床應(yīng)用領(lǐng)域，是目前研究最活躍的基因治療載體之一，已經(jīng)有超過(guò)200個(gè)AAV藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)和3個(gè)藥物已上市。AAV由一個(gè)蛋白質(zhì)衣殼組成，該衣殼包裹著一個(gè)大小約為4.7kb的小基因組，并依賴于與輔助病毒的共感染來(lái)進(jìn)行復(fù)制。AAV衣殼由三種病毒蛋白（VP1、VP2和VP3）組成，其比例、鑒別、純度影響藥物效能和效價(jià)強(qiáng)度，需要被鑒定并監(jiān)控以確保藥物質(zhì)量。AAV衣殼是病毒基因組的保護(hù)結(jié)構(gòu)，也是病毒復(fù)制的起源和包裝信號(hào)，是影響病毒感染活性和基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵因素。不同血清型之間的衣殼蛋白質(zhì)具有較高一致性，因此在基因治療方法的開(kāi)發(fā)和商業(yè)化過(guò)程中需要使用高效、可靠的載體鑒定方法。

為使VP1、VP2和VP3可視化，我們利用SDS-PAGE銀染法來(lái)產(chǎn)生定性數(shù)據(jù)，此過(guò)程耗時(shí)費(fèi)力且重現(xiàn)性差。LabChip®GXII Touch™蛋白分析系統(tǒng)提高了AAV純度分析的速度、通量和數(shù)據(jù)質(zhì)量。利用SDS存在下的微流控毛細(xì)管電泳技術(shù)分離AAV衣殼蛋白，并測(cè)定每種病毒衣殼蛋白的大小和濃度。

LabChip®GXII Touch™系統(tǒng)的ProteinEXact™試劑采用系統(tǒng)校準(zhǔn)步驟，可實(shí)現(xiàn)高精度重現(xiàn)性，并具有更高的靈敏度和較寬的分析范圍。65秒內(nèi)即可完成樣品分析。這種高通量的分析方法可以同時(shí)測(cè)定96份AAV樣品，并提供傳統(tǒng)毛細(xì)管電泳無(wú)法比擬的可比結(jié)果。

• 利用ProteinEXact™試劑，LabChip®GXII Touch™蛋白分析系統(tǒng)可以提供：
• 定量和數(shù)字化的結(jié)果
• 標(biāo)準(zhǔn)化分析流程
• 多個(gè)用戶、多臺(tái)儀器上結(jié)果的可重復(fù)性
• 分析速度快
• 高通量

圖1：（A） LabChip® GXII Touch™儀器（B）芯片，可測(cè)試多達(dá)400個(gè)樣品（C）顯示蛋白質(zhì)如何在微流控通道中得以分離和脫色

Protein EXact™ Assay檢測(cè)AAV衣殼蛋白

AAV的熱穩(wěn)定性因血清型不同而有所變化，衣殼蛋白組成的比例類(lèi)似，即VP1:VP2:VP3=1:1:10²。LabChip®GXII Touch™蛋白鑒定系統(tǒng)采用PerkinElmer的ProteinEXact™分析技術(shù)，利用IntelliChip™分析優(yōu)化技術(shù)，使樣品的蛋白濃度分析具有高分辨率和可重復(fù)性，從而使重組病毒生產(chǎn)的AAV鑒定具有最高的準(zhǔn)確性。

圖2：AAV8完全變性后衣殼蛋白Labchip電泳圖譜，樣品重現(xiàn)性好

幾種血清型(AAV2、AAV8和AAV9)的空衣殼顆粒被用于這些實(shí)驗(yàn)。為了分離衣殼顆粒，AAV樣品在洗滌劑的存在下反復(fù)加熱。由于不同的AAVs具有不同的穩(wěn)定性，因此對(duì)每個(gè)血清型分別選擇了不同的溫度。如圖2所示，完全變性的AAV8顆粒在SDS存在的情況下，在80℃加熱后，只有三個(gè)峰的分子量分別為80、90和115kDa左右。

AAV動(dòng)力學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)（穩(wěn)定性）

為了研究AAV變性的時(shí)間條件，對(duì)每個(gè)重組構(gòu)建體進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)。LabChip™GXII Touch™蛋白鑒定系統(tǒng)能夠在30-50秒內(nèi)收集多達(dá)300個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，這可能為衣殼蛋白提供額外的信息。
 

圖3A和3B：動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)中部分變性的AAV8（圖3B—只顯示二聚體）

部分變性衣殼可由不同蛋白質(zhì)分子量(單體、二聚體、三聚體等)的混合物組成，如圖3所示。在實(shí)驗(yàn)期間。在1% SDS和TE緩沖液中加入AAV樣品的96孔板被加熱到特定的溫度進(jìn)行變性，隨后進(jìn)行檢測(cè)。

AAV糖基化檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

一些研究者在LabChip®GXII Touch™蛋白表征系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)中，觀察到VP3的主要峰上有明顯的“小峰”。最近，Sara Murrey等人報(bào)道了AAV2衣殼蛋白的糖基化，并從理論上估算了衣殼蛋白表面糖基化的四個(gè)可能位置。為了研究衣殼糖基化的假設(shè)，我們使用我們研發(fā)實(shí)驗(yàn)室之前開(kāi)發(fā)的酶處理(PNGase F消化)對(duì)AAV2、AAV8和AAV9顆粒進(jìn)行去糖基化；圖4中的數(shù)據(jù)顯示了處理前(a)和處理后(b)的AAV8。在圖4b中，觀察到VP3峰的分子量變化為79 kDa，而圖4a中未處理的VP3的分子量變化為81kDa。對(duì)于VP2 (92kDa vs. 94kDa)和VP1 (113kDa vs.115 kDa)，可以觀察到大約2kDa的相同變化。觀察結(jié)果與衣殼蛋白上糖基化的平均分子量一致。
 

圖4A和4B：變性AAV8去糖基化結(jié)果

為了證明去糖基化的再現(xiàn)性，我們對(duì)變性的AAV顆粒進(jìn)行了額外的實(shí)驗(yàn)。圖5顯示了與圖4相同的三種衣殼蛋白分子量變化的重疊電泳圖。此外，在LabChip®GXII Touch™蛋白分析系統(tǒng)中也可以顯示虛擬膠圖結(jié)果，其前后的分子量變化非常明顯。

圖5：去糖基化前后AAV8檢測(cè)結(jié)果

我們展示了LabChip®GXII Touch™蛋白分析系統(tǒng)上利用ProteinEXact™對(duì)AAV樣品進(jìn)行多項(xiàng)檢測(cè)的結(jié)果，證明該平臺(tái)提供AAV衣殼蛋白的全面分析的能力。該方法為AAV衣殼蛋白鑒定提供了一種快速、高通量、穩(wěn)定可靠的方法。高重現(xiàn)性和準(zhǔn)確的衣殼成分檢測(cè)可以作為重組AAV病毒顆粒表征的新方法，是基因治療應(yīng)用的關(guān)鍵一步。另外，衣殼蛋白糖基化的高分辨率驗(yàn)證進(jìn)一步有利于重要治療成分的生產(chǎn)。