熒光素酶報告系統(tǒng)在腫瘤細(xì)胞系構(gòu)建和研究中的應(yīng)用及優(yōu)勢

盡管有些腫瘤或疾病確實是由于基因組本身遺傳信息改變所致，但是表觀調(diào)控有時能更好地闡述腫瘤或疾病發(fā)生的機(jī)制。在課題進(jìn)展中，尤其是在確定表型之后，我們往往從表觀調(diào)控，或轉(zhuǎn)錄調(diào)控，或蛋白修飾的方向去研究表型發(fā)生的機(jī)制。差異基因與表型間的關(guān)系往往是比較容易確定的，機(jī)制的挖掘則相對復(fù)雜！熒光素酶報告系統(tǒng)（Luciferase reporter）是檢測轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動子區(qū)DNA相互作用的一種檢測方法。作為機(jī)制研究利器，如果我們想要研究某個轉(zhuǎn)錄因子是否能與某一靶啟動子片段有作用。首先將靶基因啟動子或其他待研究基因調(diào)控元件插入到熒光素酶報告基因前方，構(gòu)建成報告基因質(zhì)粒。然后，將可以表達(dá)待檢測轉(zhuǎn)錄因子質(zhì)粒與報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞；如果此轉(zhuǎn)錄因子能夠激活靶啟動子，則熒光素酶基因就會表達(dá)，熒光素酶的表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄因子的作用強(qiáng)度成正比；再加入特定熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應(yīng)，產(chǎn)生熒光。通過檢測熒光的強(qiáng)度可以測定熒光素酶的活性，從而判斷轉(zhuǎn)錄因子是否能與此靶啟動子片段有作用。下面小編就給大家介紹一篇熒光素酶在腫瘤機(jī)制研究中的應(yīng)用案例實驗步驟。
 

第一步：穩(wěn)轉(zhuǎn)熒光素酶（Luc）基因的腫瘤細(xì)胞系構(gòu)建

這篇文章采用的是慢病毒遞送的方式，也是目前構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的主流方法。用含有Luciferase基因的慢病毒質(zhì)粒+MD2G+psPAX2，三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48-72小時收細(xì)胞上清，然后用去除細(xì)胞碎片的慢病毒感染腫瘤細(xì)胞。感染48-72小時后，用WB或流式或熒光顯微鏡驗證轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。這里同時插入了Luc和EGFP，中間用IRES隔開，Luc和GFP獨立表達(dá)，非常巧妙，當(dāng)然也是常用的實驗手段。
 

第二步：穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的驗證

作者同時插入了Luc和GFP，因此下面同時用了流式檢測GFP陽性率和用熒光素酶檢測試劑盒檢測了Luc的表達(dá)水平。因為有時候慢病毒整合的位點和拷貝數(shù)不一樣，會破壞宿主基因的表達(dá)，可能出現(xiàn)一些好的克隆和差的克隆。作者挑取了3個克隆，從流式和Luc檢測結(jié)果來看，#12克隆最好。
 

在此，建議大家在做穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的時候，至少要挑選和嘗試3個以上的克隆~

流式細(xì)胞術(shù)評價腫瘤細(xì)胞系的轉(zhuǎn)導(dǎo)

熒光素酶表達(dá)驗證

第三步：體內(nèi)腫瘤模型的建立

此外，作者還進(jìn)行了皮下接種（subcutaneous，s.c.）和靜脈注射（intravenous，i.v.）穩(wěn)轉(zhuǎn)的腫瘤細(xì)胞系，并分別在接種后第7天和第10天進(jìn)行體內(nèi)成像。與體外結(jié)果一致，#12克隆誘導(dǎo)腫瘤的效果最好。到這里已經(jīng)成功建立了小鼠腫瘤模型，后面就可以用作腫瘤治療或敲除的模型了。
 

監(jiān)測小鼠白血病模型中的腫瘤負(fù)荷

熒光素酶報告系統(tǒng)并不是一個新技術(shù)，也不是多么高大上，但是絕對是機(jī)制研究的利器。

逐典螢光素酶報告基因

針對報告基因檢測不同的側(cè)重需求，逐典推出了3種檢測系統(tǒng)。