長鏈非編碼RNA SNHG8通過在缺氧炎癥環(huán)境中釋放HIF-1α來激活NF-κB

正畸牙齒移動（OTM）是由機械力刺激引起的一種獨特的骨重塑過程。在牙槽骨重塑之前，局部微環(huán)境中會出現(xiàn)一系列復雜且協(xié)調的生化信號，包括炎癥反應和缺氧反應。牙周膜細胞（PDLCs）是牙周組織中的主要功能細胞，在牙周組織重塑過程中對機械轉導至關重要，由于血液供應減少，可能會出現(xiàn)暫時性缺氧。參與缺氧反應的缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）在牙周膜的壓力側和張力側均升高。然而，很少有研究調查 HIF-1α 在 OTM 期間在 PDLCs 中的作用。

牙周組織重塑伴有無菌性炎癥。NF-κB 通路被正畸刺激激活，從而觸發(fā)下游生化事件。抑制 NF-κB 可顯著阻斷 OTM 并減少破骨細胞的形成。免疫細胞中的 HIF-1α 和 NF-κB 通路之間發(fā)生廣泛的串擾，特別是在病理情況下。然而，在 OTMs 的生理條件下，PDLCs 中 NF-κB 通路的活性是否受 HIF-1α 的影響尚不清楚。

lncRNA SNHG8 通過在腦微血管內皮細胞中海綿化 miR-425-5p 來抑制 sirtuin1 介導的 NF-κB 通路。此外，在缺氧條件下，SNHG8 表達在 H9c2 大鼠心肌細胞中上調，并激活 NF-κB 通路。因此，在某些表型情況下，SNHG8 與炎癥和缺氧反應密切相關，也可能在正畸力誘導的協(xié)調生化反應中發(fā)揮作用。然而，SNHG8 的表達模式及其在 OTM 過程中對 NF-κB 通路的影響尚不清楚。

基于此，北京大學口腔醫(yī)學院正畸科及中日友好醫(yī)院口腔科的研究團隊曾探索了 SNHG8 是否對正畸刺激有反應，以及其對 OTM 期間 PDLCs 中 NF-κB 通路的影響以及潛在的機制。具體內容發(fā)表在 Stem Cell Research & Therapy 期刊題為“A reduced level of the long non-coding RNA SNHG8 activates the NF-kappaB pathway by releasing functional HIF-1alpha in a hypoxic inflammatory microenvironment”。
 

首先，實驗通過施加正畸力3天建立 OTM 模型。免疫組化染色顯示，HIF-1α 在磨牙近中壓力側 PDL 組織中的表達明顯升高。受力7天后，qRT-PCR 結果顯示，HIF-1α mRNA 水平略有升高，而 IL-1β 和 TNF-α 水平顯著升高。相比之下，SNHG8 mRNA 水平顯著下降。

然后將 PDLCs 暴露于靜態(tài)壓縮力（2 g/cm²）（圖1 A）。qRT-PCR 結果顯示，HIF-1α 和炎癥因子 IL-1β、IL-6、IL-8 和 TNF-α 的 mRNA 水平以時間依賴性方式顯著升高，而SNHG8 以時間依賴性方式下調（圖1 B）。此外，Western blot 顯示 HIF-1α 蛋白水平呈先上調后下調的變化。phos-p65 的上調和 IκBα 的下調表明 NF-κB 通路的激活（圖1 C）。這表明，機械力上調 PDLCs 中的缺氧和炎癥反應并下調 SNHG8。

圖1 機械力上調 PDLCs 中的缺氧和炎癥反應并下調 SNHG8。

細胞受到靜態(tài)壓縮力 0、6、12、24 h。（A）施加的壓縮力。（B）qRT-PCR結果顯示，施加力后PDLCs中SNHG8、HIF-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表達。（C）施加力后 HIF-1α、p65、phos-p65 和 IκBα 的蛋白質印跡分析。

體內和體外結果顯示，正畸力負荷上調炎癥因子，顯著下調 SNHG8。接下來，為了確定 SNHG8 是否參與 PDLCs 中 NF-κB 通路的調控，實驗進行轉染以敲低或過表達 SNHG8。熒光顯微鏡顯示，慢病毒轉染后，約 80% 的 PDLCs 表達綠色熒光蛋白（圖2 A）。qRT-PCR 結果顯示，SNHG8 在敲低組中下調約60%，在過表達組中下調 100% 以上（圖2 B）。PDLCs 中的 NF-κB 信號通路被 TNF-α 激活，qRT-PCR 顯示 IL-1β、IL-6 和 IL-8 以濃度和時間依賴性方式顯著上調（圖2 C）。因此，在隨后的實驗中使用 100 ng/mL 的 TNF-α，持續(xù)24 小時。與 si-NC 組相比，敲低 SNHG8 導致 IL-1β、IL-6 和 IL-8 mRNA 水平上調，而 SNHG8 的過表達下調了這些炎癥因子（圖2 D）。Western blot 分析證實，敲低 SNHG8 可提高 phos-p65 蛋白水平并促進 IκBα 蛋白的降解，而過表達 SNHG8 可降低 phos-p65 蛋白水平并逆轉 IκBα 蛋白的降解（圖2 E）。這表明，SNHG8 抑制 PDLCs 中的 NF-κB 信號通路。

圖2 SNHG8 抑制 PDLCs 中的 NF-κB 信號通路。

用針對 SNHG8 的小干擾 RNAs（si-SNHG8）、siRNA 對照（si-NC）和含有全長 SNHG8（SNHG8）的重組熒光標記慢病毒以及對照（NC）轉染細胞，以敲低或過表達其表達。（A）熒光顯微鏡顯示 NC 組和 SNHG8 組 PDLC 的轉染效率。（B）qRT-PCR結果顯示SNHG8敲低組和過表達組的相對SNHG8表達。（C）qRT-PCR結果顯示TNF-α刺激后IL-1β、IL-6和IL-8的mRNA表達。（D）qRT-PCR結果顯示，在TNF-α刺激下，SNHG8被敲低或過表達后，IL-1β、IL-6和IL-8的相對RNA表達。（E）蛋白質印跡分析顯示 SNHG8 敲低或過表達對 PDLCs 中 TNF-α 誘導的 NF-κB 通路激活的影響。

然后，為了研究 SNHG8 調控 NF-κB 通路的機制，采用 SNHG8 載體轉染后進行 RNA 測序。結果顯示，與對照組相比，SNHG8 過表達組有820個 mRNAs 表達差異。GO富集分析表明，改變的 mRNAs 在細胞對缺氧的反應中富集。qRT-PCR 顯示，兩組 SNHG8 幾乎完全定位于細胞核，提示 SNHG8 在細胞核中起作用。qRT-PCR 驗證了受 HIF-1 調控的下游靶基因 AQP1、RORA、RGCC、VEGFA、PTGIS 和 PPARGC1A 這6個基因在 SNHG8 過表達組中的表達下調。此外，HIF-1α 激動劑二甲基草酰甘氨酸（DMOG）逆轉了 SNHG8 對 HIF-1 下游靶基因的抑制作用，表明 SNHG8 通過與 HIF-1α 相互作用來阻止 HIF-1 介導的下游靶基因激活。

根據(jù) RNA 測序數(shù)據(jù)，實驗假設 SNHG8 與 HIF-1α 結合，并通過 CatRAPID 證實了 SNHG8 和 HIF-1α 之間的相互作用，相互作用強度為 95%，表明 SNHG8 與 HIF-1α 特異性結合。

最后，為了確定 SNHG8 對 NF-κB 通路的調節(jié)作用是否具有 HIF-1α 依賴性，實驗在壓縮力負荷后敲低 SNHG8，并使用 HIF-1α 抑制劑 YC-1 下調 HIF-1α。此外，在過表達 SNHG8 后，使用 HIF-1α 激動劑 DMOG 上調 HIF-1α。Western blotting 顯示施加機械力后，100 μM 的 DMOG 導致 HIF-1α 的最大上調（圖3 A），100 μM 的 YC-1 抑制 HIF-1α 的積累（圖3 B）。Western blot 分析證實，敲低 SNHG8 會增加 NF-κB 通路的激活，而抑制 HIF-1α 則逆轉了這些作用（圖3 C）。SNHG8 的過表達降低了 NF-κB 通路的活性，然而，補充 HIF-1α 逆轉了這種效應（圖3 D）。這些結果表明，SNHG8 以 HIF-1α 依賴性方式調控 NF-κB 通路。

圖3 SNHG8對NF-κB通路的影響取決于HIF-1α。

（A）DMOG刺激后PDLC中HIF-1α的蛋白質印跡分析。（B）在PDLC中施加力和YC-1刺激后HIF-1α的蛋白質印跡分析。（C）有或沒有SNHG8敲低，有或沒有YC-1刺激下施加壓縮力后phos-p65和IκBα的蛋白質印跡分析。（D）有或沒有 SNHG8 過表達，有或沒有 DMOG 刺激下在 PDLC 中施加壓縮力后 phos-p65 和 IκBα 的蛋白質印跡分析。

圖4 示意圖顯示，在 PDLCs中，SNHG8 與 HIF-1α 結合，并在正畸壓縮力下顯著下調。功能性 HIF-1α 增加以促進下游轉錄活性，從而激活 NF-κB 通路。

總之，該研究結果表明，正畸力在體內和體外誘導缺氧和炎癥反應，導致 HIF-1α 穩(wěn)定和 NF-κB 激活。SNHG8 與 HIF-1α 結合，并在 OTM 期間顯著下調。游離功能性 HIF-1α 被釋放以促進轉錄活性，從而激活 NF-κB 通路（圖4）。這些發(fā)現(xiàn)表明了 OTM 中組織重塑的調控機制。

參考文獻：Wang C, Yang Q, Han Y, Liu H, Wang Y, Huang Y, Zheng Y, Li W. A reduced level of the long non-coding RNA SNHG8 activates the NF-kappaB pathway by releasing functional HIF-1alpha in a hypoxic inflammatory microenvironment. Stem Cell Res Ther. 2022 Jun 3;13(1):229. doi: 10.1186/s13287-022-02897-x. PMID: 35659362; PMCID: PMC9166574.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35659362/或點擊閱讀原文

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